げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

無菌技術は、実験結果を混乱させることができるマウスに外因性の感染性病原体の不注意な導入を避けるために動物に投与されるすべての材料に適用する必要があります。

1。血液ステージマラリア原虫を持つ実験用マウスの感染症

1. 室温で、交差する冷凍血液ステージマラリア原虫を含む二つのバイアルを解凍。この例では、使用される2つのげっ歯類のマラリア原虫の株は、 マラリアyoelii yoeliiとマラリアyoeliiのnigeriensisです。
2. 22から30ゲージ（G）針と注射器を取り付け、滅菌、医薬品グレードのPBS（pH7.4）を400μLを描く。
3. 同じ注射器を使用して、解凍した感染血液100μLを立て、内容が均一に混合されるまで上下シリンジを反転させる。 （オプション：ピペットを注入用注射器に転送する前にコレクションチューブにPBSと感染した血液を転送するために使用されることがあります）。
4. マウスの腹膜に直接溶液を含む寄生虫の200μLを注入する。終了したら、鋭利ビンの注射器を廃棄する。 （また、実験用マウスの維持のための補足資料を参照してください）​​。一般的には、接種の標準サイズは、オリジナルの冷凍材料における寄生虫感染症のレベルに応じて、100〜500μLの間です。
5. つのマウスそれぞれに交差する二つの寄生虫株を注入する。マウスは、顕微鏡的に3〜5日間注射した後に正となる。 parasitemiasは1-5％の間に到達すると、次の手順に進みます。

2。マウスの混合クローン感染

1. 混合クローンの感染前に、（詳細な手順については補足資料を参照してください）​​ギムザ染色した血液を薄める塗抹標本による顕微鏡検査（図3）、および赤血球の密度の測定のためのさまざまな寄生虫株に感染twoドナーマウスから尾部血を採取する。
2. 以前取得した寄生虫血と赤血球の密度測定を使用して、生理食塩水（1.5％w / vのクエン酸三ナトリウム二水和物、0.85％（w / v）の塩化ナトリウム）と接種の混合物を生成するために必要なマウスの血液の量を計算します。
3. 100μlの100万件の感染赤血球の最終濃度に寄生虫ソリューションを調整します。
4. 混在クローン接種を得るために1:1の比率で2つのドナーから感染した血液を組み合わせる。 2つの親のクローンは、成長率が異なるときは、1:2または1:5の遅い成長している親クローンの親の急成長の割合を調整する。
5. 感染していることが、各マウスの腹腔内に混合試料の100μLを注入する。 （注入するマウスの数を決定するために3.9をステップも参照）
6. この方法を使用して、単一の親系統とのそれぞれ2つのマウスに感染する。単一クローンの感染は2つの親系統の正常な伝送の決定が可能になります。

3。摂食蚊

1. 300から500までの成人（男性と女性）ハマダラカ蚊それぞれ、蛹から年齢5〜7日のポスト出現を備えた三ケージを用意します。容器は、プラスチックまたは金属製の蓋で安全な網で覆われている。二つのケージは、親のクローンに供給するためであり、第三ケージは、遺伝的交雑の準備のためです。
2. 混在クローン感染後4日以降、感染マウスからギムザ染色した血液を薄めるの尾の塗抹標本を準備する。
3. 1000X倍率で少なくとも50顕微鏡のフィールドを走査することにより顕微鏡下で塗抹標本を調べ、男性と女性のgametocytesが存在するかどうかを決定する。
4. 男性と女性のgametocytesは大きな液胞と大型顆粒の存在（図3）に起因する認識です。男性と女性のgametocytesはそれぞれ、ピンクとブルーの細胞質を持っている。 gametocytesが存在する場合は、ステップ3.6に従ってください。
5. gametocytesが存在しない場合は、表示されるまで、毎日監視をしてください。 gametocytesが存在する場合、次の手順を続けます。
6. 33 mg / mLのケタミンのと、それぞれ感染したマウスを（20グラムのマウス体重あたり）麻酔マウスの腹膜にキシラジンの3 mg / mLのを含む麻酔薬のカクテルの50μLを注入する。ケタミンとキシラジンの最終的な投与量はそれぞれ82.5と7.5 mg / kgを、です。
7. マウスは24時間のために砂糖の供給が不足し、蚊が中断することなく30分間供給することを許可されている成人のハマダラカ蚊を含むケージの上に伏せて置きます。
8. 標準的な条件下での昆虫館で蚊を維持する（温度を24〜26 ° Cの間で維持される;も研究室蚊の維持のための補助メソッドも参照）。
9. すべての50から100メスの蚊用の感染マウスを使用してください。マウスは、麻酔下にまだある間、給餌後に頚椎脱臼によりすぐにマウスを安楽死させる。

4。解剖モスキートMidgUTSとカウントオーシスト

1. 九日給餌後、蚊は昆虫の中腸におけるオーシストのために調べられます。単クローン感染マウスでの飼料は2つの親系統のgametocytesが感染していることを示している蚊のオーシストの存在。
2. 蚊中腸を解剖するために、ケージから徒歩5〜10感染した蚊を収集するための小さな容器に接続されてアスピレーターを使用してください。
3. CO ₂ガスを使用して、蚊を麻酔し、氷の上にガラスシャーレに入れ、それらを転送する。オス蚊を分離して捨てる。男性のアンテナは、女性に比べて著しくbushierです。
4. PBSで2つのシリンジを記入し、26ゲージ半インチ（G ^½）針とそれらをフィット。スライドグラス上にシリンジからのPBS 100μL程度預金。
5. PBSのドロップに5〜10麻酔メスの蚊を移し、解剖顕微鏡でスライドを配置する。
6. 同じ針を使用すると、胸部と後腹部に昆虫を持って、その後、各蚊の羽と足を削除、中腸、白い袋状体、リリースされるまでは離れて身体を引っ張る。腸を切り離し、本体の残りの部分を捨てる。
7. スライドが乾燥している場合腸に多くのPBSを追加。乾燥させる場合腸が退化します。 midgutsにカバースリップを置きます。
8. 100倍の倍率で、光学顕微鏡下でmidgutsを調べます。 （図3）それぞれの中腸でオーシストの数を数える。オーシストはmidgutsの外面上にある厚肉円形の構造物として認識できます。
9. 終了したら、注射器、針、そして鋭利ビンのスライド処分する。
10. オーシストはmidgutsに存在しない場合、gametocytesの高い数と感染したマウスで蚊を供給し、より長い餌の時間を与える。温度は、このステップが重要です。温度が24から26℃に設定されていることを確認

5。遠心法による蚊からスポロゾイトを収集

1. 次のようにスポロゾイトコレクションチューブを準備します。クリーンな0.5 mLの遠心管の蓋をカットし、燃え上がる19 Gの針を使用してチューブの底に穴（0.1〜0.2ミリメートルの直径）をパンチ。
2. グラスウールとチューブの1 / 3を埋める。 1.5 mLのコレクションチューブ（一管が約100蚊からスポロゾイトを収集するのに十分である）にフィルターチューブを挿入します。
3. 17日目後の給餌では、ケージからアスピレーターを使用して、小さな容器の中に蚊を（ステップ4）を収集。
4. 蚊を麻酔するためにCO ₂ガスを使用してください。
5. 男性蚊から女性を区切ります。容器から氷の上にガラスシャーレに麻酔したメスの蚊を転送します。
6. 26 G ^½ PBSで満たされた注射針で2つのシリンジを準備します。スライドグラス上にシリンジからのPBS 100μL程度預金。
7. 顕微鏡スライド上に蚊を転送する。解剖顕微鏡下で蚊の頭、翼、脚、腹部を削除します。
8. 先の細いピンセットを使用すると、1.5 mLのホモジナイザー（乳鉢と乳棒）の0.5mLのPBS中に胸部を移す。氷の上胸部を保存する（スポロゾイトは2〜3時間感染のまま）。
9. （図3を参照）唾液腺からスポロゾイトを解放するために氷の上胸部をホモジナイズし、ガラスピペットを用いて、ガラスウール（ステップ5.1から5.2）で満たされたチューブにライセートを（ホモジネート）に転送。
10. 室温で1000rpmで10〜20秒間遠心します。
11. フロースルー（精製のスポロゾイトの懸濁液）22から30 Gの針と注射器を使用して収集する。 （オプション：ドロップフロースルーを顕微鏡スライド上に、カバーが標準的な光学顕微鏡、400X倍率下でのライブスポロゾイトをスリップし、視覚に配置、また、参照して図3の10〜50μL）
12. マウスにスポロゾイトサスペンションのIP 0.1から0.5 mLを注入する（最大200,000寄生虫への単一の蚊から収穫することができる。文献12を参照してください）​​。成功した場合には、動物は注射後72時間を感染します。

6。限界希釈を用いてクローニング子孫

1. スポロゾイトの注射後の七十二時間、（詳しい手順については補足資料を参照してください）​​薄い血液塗抹標本のギムザ染色後、赤血球の細胞密度の測定のための顕微鏡検査のための別の寄生虫の株に感染twoドナーマウスから尾部血を採取する。
2. 0.1から1パーセントの寄生虫を表示するマウスを選択し、その感染した赤血球は、クローニングプロシージャのためのドナーとして、主に単一の寄生虫が含まれています。マウスは微視的に負の場合、6.1次の日繰り返します。動物は14日以内に感染していない場合、）5にステップ2を繰り返し、ステップ5.11スポロゾイトの存在を決定する。
3. CONを達成するように子牛血清と哺乳類リンゲル液の冷1:1溶液（2.7 mMの塩化カリウム、1.8 mMの塩化カルシウム、154 mMの塩化ナトリウム）で収穫された尾の血を薄める100μLあたり0.6から1に感染した赤血球のセンタリング、そして氷の上に接種して保存する。このように、個々のマウスのほとんどは、1または0の寄生虫のいずれかを受信する必要があります。
4. 静脈内投与50から100のマウスのそれぞれの希釈感染血液100μLを注入する。
5. 5〜7日後、ギムザ染色した血液を薄めるの塗抹標本を調べることによって、血液ステージ寄生虫の存在のためのマウスをスクリーニングする。成功した実験で、マウスの20〜50％が感染すると8日目、感染後に0.1から5.0パーセントの寄生虫が表示されます。

7。遺伝マーカーを用いて後代の特性評価

1. チルド生理クエン酸食塩水、ボルテックスを短時間、及びペレットに室温で3000rpmで3分間遠血液細胞の0.2mLを含んでいる1.5 mLのマイクロ遠心チューブにマウスの尾の血液の20〜40μLを収集する。すぐにDNAを抽出または-80ペレット℃を保つ
2. 任意の標準的なDNA抽出法を用いて寄生虫のDNAを準備します。 DNAの迅速分離のために、高純度PCRテンプレート調製キット（ロシュダイアグノスティックスバイオサイエンス）を使用します。
3. 組換え子孫は、マイクロサテライト（MS）や遺伝的交雑の2つの親系統を区別できる、異なる染色体上の一塩基多型（SNP）を用いて遺伝子型の後に識別されます。 P.のMS遺伝子タイピングのための単一蛍光標識したプライマーを用いて、簡便法yoeliiは、（REF 8,9を参照）を使用することができる。

8。血液ステージマラリア原虫の凍結保存

1. 50〜10 mLの50から20パーセントの寄生虫血で麻酔マウスから心臓穿刺による感染血液の0.5〜1 mLを収集するには、生理食塩水を冷やした。
2. 室温で2000rpmで5分間遠心する。上清を捨てる。
3. 血液のペレットにGlycerolyte 57ソリューション（Fenwalの研究所）の滴2倍のボリュームを加え、よく混ぜる。
4. クリオチューブ（試験管当たり0.2から0.5 mL）に懸濁液を移す。
5. -80 ° C（最大1ヶ月）で、または液体窒素で凍結保存した血液を保管してください。

9。代表的な結果：

成功した実験では、クローン化された行の5〜10％は、独立した組換え子孫になります。

図1。遺伝的交雑の間にライフサイクルと遺伝的組換え現象の概略を表現。遺伝子組換えイベントは、蚊の開発の初期段階で行われる。蚊の中腸の異なる遺伝的背景の"半数体"男性と女性の配偶子の受精に続いて、"二倍"受精卵が形成されています。接合子は、寄生虫のライフサイクルの唯一の二倍のステージを構成し、減数分裂は受精の12時間以内に従っており、蚊や哺乳類のすべての後続の段階では、半数体のまま。結果として得られる受精卵はookinetesとオーシストに開発しています。各オーシストの生育と有糸分裂は、蚊"hemocealに放出されるスポロゾイト、数千を生成します。唾液腺に移行それらのスポロゾイトが肝臓と赤血球の段階の開発が行われる哺乳動物宿主、に送信する立場にあります。赤血球サイクルの過程で、いくつかの寄生虫が成熟したオスとメスgametocytesに分化することができる。これらのgametocytesが伝送を永続させる、別の蚊によって取り込まれる際に寄生虫のライフサイクルは完了です。

図2。マラリア原虫と組換え後代の生産における核遺伝子の継承。遺伝子組換えは、染色体の再集合を介して、またはクロスオーバーのイベントによって生成することができます。ホモ接合性の子孫は、同じ親クローン1または2（AとD）、それぞれの配偶子の間に自殖によって生成。 B）二つの異なる親のクローンを、単独で染色体の再集合によって形成されている組換え核（青い楕円）の配偶子間のクロス受精によって生成されるヘテロ接合子孫。 C）相同染色体の非姉妹染色分体の間に陸橋が形成されている2つの異なる親のクローン、組換え核（赤楕円）の配偶子間のクロス受精から生産ヘテロ接合子孫。

図3。げっ歯類のマラリア原虫yoeliiの形態。 10日目のポストでオーシストを持つA）段リング、B）栄養型、C）シゾント、D）メロゾイト、E）幼若雄生殖母体、F）成熟した雄の生殖母細胞、G）未成熟雌の生殖母体、H）成熟した雌の生殖母体、私は）中腸給餌（矢印で示される成熟したオーシスト、200倍）、J）蚊の唾液腺（100 ×倍率）、K）スポロゾイト（400X倍率）。

我々はまた、他のげっ歯類malariasの遺伝的交雑の製造に適用可能である齧歯類マラリア原虫yoelii、の遺伝的交雑の生産のための手法を示します。単一の親のクローンを持つマウスの感染は通常、親がクロスを実行する前に、機能的な配偶子の生産で有能であることを保証するために親の寄生虫の転送に成功したことを判断するために実行されます。

蚊を介して転送の成功は、昆虫館の温度、使用される齧歯類のマラリア原虫の種、および血液ステージ寄生虫の投与（接種のサイズ）を含む複数の要因によって影響される。 P. bergheiの伝送は、通常、19〜21 ° C ^13、P.の伝送が達成されている間yoeliiとP. chabaudiは日常的に23〜25 ° C ¹⁴で実行されます。 P.のOokinetes bergheiは温度でオーシストに開発するために失敗する16℃より低い、または24℃以上^15。温度に加えて、接種量は、血液中のマラリア原虫の増殖率に影響を与えることができます。大規模な接種量の注射は（5 × 10 ⁶ iRBC以上）感染の非常に早い段階でより高い寄生虫が得られるものの、それは必ずしもgametocytesや蚊に高い感染力の大きな数字につながるものではない。ガッズビーとその他^{（2009）16は、P.} chabaudiアダミのgametocytesは20日目に3日目（13日目でのピーク）から血液中にiRBC 1 × 10 ⁶の感染後に存在することを示したが、6日目、感染後にのみです。毎日これにより蚊が感染する。また、このようなクローンN67（nigeriensis）、17XL、およびP. yoeliiのYM、P.のクローンANKAとして急成長していると病原性原虫株の大規模な接種量の投与マウスの体温の著しい低下を引き起こす可能性マウスの重症貧血と病理のberghei、およびP. chabaudiアダミのクローンDSは、しばしば結果、。その結果、マウスは、蚊が少なく感染（未発表所見）になる。それにもかかわらず、げっ歯類のマラリア原虫の伝送は、標準的な接種量（10 ⁶ iRBC）で行われている。それは見出されているP. bergheiとP. P. chabaudi chabaudiとP. chabaudiアダミは、マウス^16、18の血液段階誘発性感染症の後、6日目に蚊にのみ感染するのに対しyoeliiは 、マウス¹⁷の血液段階誘発性感染後5日間の3から蚊への伝染です。

組換え子孫の生産に影響を与える要因には、マウスの2つの親系統のgametocytesの割合が含まれています。理論的には、組換え後代の最大生産量は親のクローンの両性のgametocytesが同数になると自家受精と他家受精が同じ周波数で発生した場合に発生します。この条件の下で、結果として得られる接合体の半分はハイブリッドになり、残りは2つの親クローンラインの等しい比率で構成されます。 gametocytesの割合は、自家受精不均等につながる、ある親クローンに偏っているときに組換え子孫クローンの生産が大幅に削減されます。また、寄生虫はしばしば異なる成長率を持っているとgametocytes ^16、19の生産に異なる能力を持つことができます。したがって、それは蚊餌用マウスに注入される混合物中の親の寄生虫の比率を最適化する必要があります。

蚊の給餌後の血中から寄生虫のクローンを作成する時間も考慮すべき重要な要素です。それは寄生虫がクローニング重複クローンを避けるために、0.1から1.0パーセント（血液中の複製の数が多すぎるのサイクルの前に）の間にあるときに遺伝的交雑の子孫のクローンを作成するのが好ましい。高速または低速成長している寄生虫は、一定期間で大量に出てくる可能性があり、高速または低速成長している寄生虫のピーク時のクローニングは、同じ表現型を有するクローンとなってしまいます。

結論として、げっ歯類のマラリア原虫を用いて遺伝的交雑を実行すると、簡単に相対し、人間のマラリア原虫P.の遺伝的交雑を行うよりはるかに安いです。ヒト以外の霊長類の感染を必要とする熱帯熱マラリア 、。遺伝的交雑の組換え子孫は遺伝的連鎖地図の構築および寄生虫の開発、薬剤耐性、および病原性などの重要なマラリア形質のマッピングのための便利なツールです。