Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

1. Селезенки В-лимфоцитов изоляции и стимуляции

1. Урожай селезенки от AID-дефицитных мышей ¹² от 2-3 месяцев. Изоляции селезенки осуществляется в стерильных условиях и органов временно храниться в холодном солевом фосфатном буфере (PBS), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
2. Селезенка затем перевели в стерильную капот культуры тканей и гомогенизировали в 5 мл PBS дополнена 2,5% FBS. Передача гомогената на 15 мл трубки сокола.
3. Центрифуга гомогенизированный образец ткани селезенки на 1000rpm в течение 10 минут при 4 ° С для осаждения клеток.
4. Декантируйте супернатант после центрифугирования. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл клеток крови красный (РБК) лизис буфера при комнатной температуре в течение 7 минут, чтобы избежать загрязнения красных кровяных телец.
5. Центрифуга образца при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут и сцедить надосадочную и ресуспендирования клеток в 10 мл PBS, содержащего 2,5% FBS.
6. Удалить 100 мкл и считать клеток в разведении 1:1000 с использованием стандартного hemacytometer с трипановым синим, чтобы исключить любой мертвых клеток. Примерно 20-30 миллионов клеток могут быть получены в селезенке.
7. Центрифуга образца при 1000rpm в течение 10 минут и сцедить супернатант.
8. Ресуспендируют гранулы в 0,5% BSA / PBS содержащей 2 мМ ЭДТА в концентрации 10 ⁷ клеток на 90 мкл.
9. Добавить анти-CD43 антитела, покрытые магнитных шариков, чтобы клетки специфически связываются не-В-клеток. Используйте 10 мкл бисером на 90 мкл (10 ⁷ клеток). Хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 минут.
10. Как только клетки были помечены, вымыть их, добавляя 2,5% FBS / PBS в верхней части трубки. Центрифуга образца при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
11. Декантируйте супернатант. Ресуспендируют клеток в 0,1% BSA / PBS в концентрации 10х10 ^{7 клеток} на миллилитр.
12. Гора магнитная сортировку колонок на магнитном сепараторе. Позиция конической трубе непосредственно под колонки для сбора проточные и нагрузки колонки с 3 мл 0,5% BSA / PBS, чтобы премьер и мыть.
13. После мытья жидкость текла через, замените ее на новую трубку коллекции. Если в образце составляет менее 1 мл, отрегулируйте объем образца до 1 мл 0,5% BSA / PBS / ЭДТА и загрузить образец в колонку. Загружать только 1 мл максимум клеток на колонке и использовать несколько столбцов, если это необходимо.
14. Разрешить клетки пассивно потока через колонку и собирают свободные клетки в конической трубе при колонке. Вымойте графе 4 раза с 3 мл 0,5% BSA / PBS, продолжая собирать проточные.
15. Соберите все проточные, в котором CD43 отрицательные покоящихся клеток B будет обогащаться. Откажитесь от колонки. Центрифуга проточные при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
16. Слейте надосадочную жидкость и добавляют 10 мл среды (15% FCS / + глютамин, Pen / Strep, Номера для Незаменимые аминокислоты, 50 мкМ Β-ME)
17. Граф клеток и культуры на 10 ^{6 клеток} на мл.
18. В целях стимулирования B клеточного роста и пролиферации, дополнения среде с рекомбинантным IL-4 и анти-CD40 антитела, такие, что окончательная концентрация 20 мкг / мл и 1 мкг / мл, соответственно, и передачи клеткам культуры колбу.
19. Культура клетки на ночь. Граф клеток и разбавить до 10 ⁶ клеток на миллилитр, добавив, IL-4 и CD40 в случае необходимости.
20. Культуры клеток для 72 часов до вирусной инфекции.

2. Трансфекция Производитель Клетки

Используйте установленные протоколы для трансфекции с использованием либо катионными липидами или фосфата кальция. Трансфекции 10 см ³ в пластине построить ДНК, с использованием 100 мкг плазмидной ДНК на пластине. Мы обычно используют фосфат кальция трансфекции метод ^{13, 14} и отметить высокий титр вирусных когда дополнен хлорохину.

1. Используйте 60% -70% сливной клетки Феникс в качестве продюсера ячейки, которые будут трансфекции. В это число клеток слияния должна быть не менее 5 миллионов клеток на 10 см тарелку.
2. За час до трансфекции, заменить средства массовой информации со свежими полной информации для роста клеток Феникс.
3. В стерильную пробирку eppendorpf, объединить 100 мкг упаковки построить ДНК, 250 мкл 0,5 М CaCl _2, а также настроить конечного объема до 500 мкл стерильной водой
4. Использование 1 мл пипетки, энергично перемешать это решение с 500 мкл 2X ГНП в 15 мл трубки полипропилена
5. Разрешить эту смесь, чтобы отдохнуть при комнатной температуре в течение 8-10 минут. За это время осадок будет форма.
6. Добавить трансфекции смесь по каплям к клеткам в то время как закрученной среды, чтобы равномерно распределить смесь во всем.
7. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 12 часов.
8. 12 часов после трансфекции, замените среду с 8 мл полной среды рост клеток B и вернуть клетки 37 ° C инкубатора.

3. Заражение Вынужденное селезенки клетки B

1. Удалить супернатант из клеток Феникс 48hr после transfection и передать супернатанта через 0,2 мкм фильтр для удаления любой ячейке мусора.
2. Смешайте 3 мл вируссодержащих супернатанта с 3 мл предварительно активированный В-клеток (как в шаге 1). В целях повышения вирусной адсорбции клеток, добавить polybrene в конечной концентрации 16 мкг на мл.
3. Infect клетки центрифугированием при 2500 оборотах в минуту в течение 90 минут при температуре 30 ° C.
4. Сразу же после спина, инкубировать дальнейшего 48-72 часов при 37 ° C для обеспечения роста и пролиферации клеток.

4. Анализ проточной цитометрии

1. Использование потока цитометр, анализировать клетки для поверхностного выражения B220 и поверхностных IgG1. Наличие IgG1 на поверхности клеток показывает, что рекомбинация класса переключатель произошло в результате успешного спасения через ретровирусных дополняемости ПОМОЩИ гена.

5. Представитель Результаты

Мы успешно спасли дефицита Активация белка фактор индуцированного дезаминазы цитидин (AID) от AID-дефицитных (AID-/ -) В-лимфоциты использовании ретровирусной трансдукции. Одним словом, мы получили рекомбинантные ретровирусы выражения мыши AID (горничная) белка путем трансфекции клеток с Phoenix PMX-рабыни GFP ^15-18. Собрано вирусы были инфицированы в AID B-дефицитных клеток, полученных от AID-дефицитных мышей в бывшей естественных класса переключатель рекомбинации (КСО) стимуляции условиях ^19. Инфицированных клеток затем были проанализированы в области КСО для IgG1 после 72 часа в культуре с использованием анализа проточной цитометрии. На рисунке 2 показан обнаружения IgG1 на поверхности В-клеток с AID, но не пустой строить, указывая, что КСО произошло в результате ПОМОЩИ спасательных выражения.

Рисунок 1: Схема ретровирусных упаковке в течение производитель клеток: Гена интерес, в лице Ψ, субклонировали PMX-IRES-GFP, как описано выше ^15. Плазмиду трансфицировали в ecotropic вирусных клеточной линии упаковки, способных производить кляп-пол и конверт белка (Феникс, Orbigen), используя метод фосфата кальция ^{13, 14.} Сорок восемь часов после трансфекции, супернатант, содержащий вирусные частицы были собраны для инфекции в целевой первичных клеток, полученных от мышей.

Рисунок 2: ПОМОЩЬ В дефицитных клеток, стимулированных анти-CD40 и ИЛ-4 были инфицированы ретровирусом содержащие PMX-рабыни GFP или ретровируса выражения GFP в одиночку. Уровень корпоративной социальной ответственности в IgG1 оценивалась с помощью анализа FACS.

Ретровирусные трансдукции клеток селезенки, как описано здесь и как изображено на рисунке 1, генетический подход, который полезен при изучении В-лимфоцитов, поскольку многие из развития событий в lymphopoesis контролируются регуляции транскрипции ^{1, 2.} В более поздних стадиях созревания В-клеток, запуская через CD40L имеет важное значение для индукции роста В-клеток, вступление в клеточный цикл, а ^{11 пролиферации, 20.} Как показано на рисунке 2, В-клетки могут стимулироваться в пробирке с анти-CD40 и IL4 пройти этого всплеска распространения, и ретровирусные векторы являются полезными инструментами для более-экспресс белки, которые могут работать на этих стадиях развития клеток. В примере, показанном на рис. 2, мы показываем, что AID-дефицитных клеток, которые не в состоянии пройти КСО (здесь, чтобы IgG1) может быть спасена для этой функции retrovirally введения гена мыши AID. Такой подход позволяет нам отслеживать для GFP-положительных клеток (см. рисунок 1), которые подверглись КСО (IgG1 + GFP +).

Этот метод имеет преимущество во мыши моделирования в том, что она может быть завершена менее чем за одну неделю после селезенки урожая, в отличие от времени инвестиций для создания трансгенных мышей. Тип анализа может быть адаптирована к приложениям, следователя, здесь мы представили анализ класс рекомбинации переключатель с помощью проточной цитометрии как показано на рисунке 2. Кроме того, этот метод подходит для целого ряда биохимических подходов следующие белка извлечения из retrovirally-трансдуцированных клетки ^{15, 21.}