Экс Vivo культуры тканей пациента и изучение генов доставки

Подготовка медиа и реагенты

1. Раствором антибиотика
   Фосфатным буферным раствором (PBS) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone
2. Сбор и очистка среды
   Дульбеко изменение орел среды (DMEM) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone
3. Культура среда
   Коллекция среде, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки

И. коллекции тканей и хранения

Утверждение для пациента коллекции тканей была получена из Клинические исследования этическим комитетом больницы Корк Обучение и информированное согласие было получено от пациентов за день до операции. Ткани печени была получена из пациентов, перенесших частичную резекцию печени злокачественных заболеваний.

1. Свежий ткани пациента получается во время хирургической резекции.
2. Ткань хранится в коллекции средств массовой информации при 4 ° С (ткани, может храниться в холодильнике до 12 ч без значительной потери жизнеспособности, однако немедленной обработки рекомендуется).

II. Ткань подготовки ломтик и культуры

Нарезки проводили с использованием vibratome (Leica, Германия). Ткани нарезки система была использована в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка ткани срез был выполнен под капотом стерильной используя инструменты очищаются 70% 2-пропанола. Толщина среза устанавливается в размере 2000 микрон и обработке с использованием поршневых лезвием на 22-26 оборотов в минуту.

1. Ткань промывают раствором антибиотика в три раза.
2. Ткань крепится к стадии монтажа использованием нетоксичных клей (Dermabond).
3. Толщина среза установлен и нарезая достигается при 22-26 оборотов в минуту.
4. Фрагменты сохраняются в культуральной среде в 6-и культуре блюд (один ломтик на лунку) при 37 ° C с 5% СО ₂ во влажной среде.

III. Гена доставки срезы тканей

1. Ломтики предварительно инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч до начала лечения.
2. Культура среду заменяют лечение среды.
3. Ломтики непосредственно вводили вирусный вектор (25 мкл вирусных частиц Ad5.CMVluc [1x10 ^9]). Кроме того, частицы могут быть добавлены к среде, для пассивных инфузии.
4. После двух часов инкубации сыворотки добавляется в среду.

IV. Анализ экспрессии генов с биолюминесцентного анализа

1. Ломтики вводят 100 мкл люциферин подложки (3 мг / мл).
2. 6-а блюдо культуры находится на сцене, и выдерживают в течение 10 мин.
3. Ломтики изображаются в течение 5 мин при высокой чувствительности (рис. 1).

Результаты В. представитель

Рисунок 1. Биолюминесцентный изображений пациента ломтика печени использованием ИВИС системы обнаружения.

Мы описываем бывших естественных тканей пациента методом культуры и биолюминесцентного системы обнаружения для оценки доставки генов в нефиксированной ткани человека. Метод предлагает простые и воспроизводимые способ ломтиками культивирования тканей. Он имеет значительный потенциал, так как позволяет изучение доставки генов в нетронутой человеческой ткани, анализ доставки генов в различных тканях человека, в том числе злокачественные ткани и могут предоставить важную информацию о влиянии высокой степенью изменчивости между отдельными пациентами в отношении к генной поглощения. Различные виды рака могут по-разному влияет на эффективность различных этапах успешного выражения трансгенов в клетках, связанных поглощения ДНК и последующей транскрипции и трансляции. Эти шаги, изложенные в видео-анимации с помощью вирусного вектора в качестве примера. Биолюминесцентного системы обнаружения демонстрирует быстрое и точное количественное экспрессии генов в отдельных ломтиков без необходимости ткани жертвы. Для репликации некомпетентных векторов, например, занятых в этом исследовании, свечения напрямую связано с генной экспрессии клетками.

Эта модель системы позволит получить ценную информацию относительно доставки генов в ткани пациента перед входом клинических испытаний.