JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

Hasta Doku ve Gen Teslimat Sınav Ex Vivo Kültür

1, 1, 2, 2, 2, 1, 1

1Cork Cancer Research Centre, Mercy University Hospital and Leslie C. Quick Jnr. Laboratory, University College Cork, 2Department of Computer Science, University College Cork

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.226.225.215, User IP: 54.226.225.215, User IP Hex: 920838615

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Bu makale, gen teslimat çalışmaları ve IVIS biyoparlaklık görüntüleme kullanarak gen ekspresyonu sonraki analiz için hasta doku dilim kültür açıklar.

    Date Published: 12/20/2010, Issue 46; doi: 10.3791/2378

    Cite this Article

    Rajendran, S., Salwa, S., Gao, X., Tabirca, S., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., et al. Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery. J. Vis. Exp. (46), e2378, doi:10.3791/2378 (2010).

    Abstract

    Bu video ex vivo gen teslim çalışması için bir model olarak hasta doku kullanımı anlatılmaktadır. Taze hasta doku cerrahi sırasında elde dilimlenmiş ve kültür tutulur. Ex vivo model sistem sağlam hasta doku ve gen ekspresyonu biyoparlaklık görüntüleme IVIS algılama sistemi kullanılarak analiz genlerin fiziksel teslimat için sağlar. Bioluminescent algılama sistemi doku kurban için ihtiyaç olmadan hızlı ve doğru tek tek dilimler içinde gen ekspresyonu kantifikasyon göstermektedir. Bu dilim doku kültürü sistemi normal ve malign doku da dahil olmak üzere çeşitli doku tiplerinin kullanılan ve bize sağlam doku heterojen doğası ve yüksek derecede bireysel hastalar arasında değişkenlik etkilerini incelemek sağlar. Bu model sistemi ve klinik araştırmaya girmeden önce bir tamamlayıcı preklinik modu olarak hayvan modellerinde bir alternatif olarak bazı durumlarda kullanılabilir.

    Protocol

    Medya ve Reaktifler hazırlanması

    1. Antibiyotik Çözüm
      Fosfat tamponlu salin (PBS) 200 U / ml penisilin, 200 mcg / ml streptomisin, 5 mg / ml fungizone
    2. Toplama ve Arıtma orta
      Dulbecco'nun 200 U / ml penisilin modifiye kartal orta (DMEM), 200 mg / ml streptomisin, 5 mg / ml fungizone
    3. Kültür ortamı
      Koleksiyon orta% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu içeren

    I. Doku toplama ve depolama

    Hasta doku toplanması için Onay Klinik Araştırmalar Etik Kurulu Cork Hastaneler Öğretim elde edildi ve hastalar operasyondan bir gün önce bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Malign hastalık için kısmi hepatektomi uygulanan hastalarda karaciğer dokusu elde edildi.

    1. Taze hasta doku cerrahi rezeksiyon zaman elde edilir.
    2. Doku toplama medya saklanan 4 ° C (Doku canlılığı kaybı olmadan 12 saat kadar buzdolabında saklanabilir, ancak hemen işleme tavsiye edilir).

    II. Doku dilim hazırlanması ve kültür

    Dilimleme bir vibratome (Leica, Almanya) kullanılarak yapıldı. Üreticinin talimatlarına göre doku dilimleme sistemi kullanılmıştır. Doku dilim hazırlanması% 70 2-propanol ile temizlenmelidir aletler kullanılarak steril bir başlık altında yapıldı. Dilim kalınlığı 2000 mikron ve pistonlu 22-26 rpm'de bıçak kullanılarak kesilir.

    1. Doku antibiyotik solüsyon içinde üç defa yıkanır.
    2. Doku, toksik olmayan yapıştırıcı (Dermabond) kullanarak montaj aşamasında eklenir.
    3. Dilim kalınlığı ayarlanır ve dilimleme 22-26 dak elde edilir.
    4. Dilimler 37 6 kuyu kültür yemekleri (her bir dilim) kültür ortamında muhafaza ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir ortam.

    III. Gen teslim doku dilimleri

    1. Dilimler ° C 2 saat önce 37 tedavi öncesi inkübe edilir.
    2. Kültür orta tedavi orta ile değiştirilir.
    3. Dilimler, viral vektör (viral parçacıkların 25 ul Ad5.CMVluc [1x10 9]). Doğrudan enjekte edilir Alternatif olarak, pasif infüzyon için parçacıklar, orta eklendi olabilir.
    4. Inkübasyon iki saat sonra, serum orta eklenir.

    IV. Bioluminescent analizi ile gen ekspresyon analizi

    1. Dilimler 100 ul luciferase substrat (3 mg / ml) enjekte edilir.
    2. 6-sıra kültür kaplarına yerleştirilir ve sahnede 10 dakika inkübe edilir.
    3. Dilimler, yüksek hassasiyeti (Şekil 1) 5 dakika görüntülü.

    V. Temsilcisi Sonuçlar

    Şekil 1
    Şekil 1 IVIS algılama sistemi kullanarak hastanın karaciğer dilim Bioluminescent görüntüleme.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Biz ex vivo olarak hasta doku kültürü yöntemi ve insan doku içinde sabit olmayan gen teslim değerlendirilmesi için bioluminescent algılama sistemi açıklanmaktadır. Bu yöntem basit ve tekrarlanabilir bir kültür dokusu dilim bir şekilde sunmaktadır. Malign doku da dahil olmak üzere çeşitli insan doku içine bozulmamış insan dokusu içine gen teslim çalışmada, gen teslim analizini sağlar ve saygı ile bireysel hastalar arasında değişkenlik derecesi yüksek olan etkileri ile ilgili önemli bilgi vermek gibi önemli bir potansiyele sahiptir gen alımı. Farklı kanser türleri, DNA alımı ve sonraki transkripsiyon ve çeviri içeren hücreler başarılı transgen ekspresyonu farklı aşamalarında etkinliğini etkiler değişik olabilir. Bu adımlar, bir örnek olarak viral vektör kullanılarak, video animasyon açıklanmıştır. Bioluminescent algılama sistemi doku kurban için ihtiyaç olmadan hızlı ve doğru tek tek dilimler içinde gen ekspresyonu kantifikasyon göstermektedir. Bu çalışmada istihdam gibi beceriksiz vektörlerin, çoğaltma, lüminesans hücreleri tarafından gen ekspresyonu ile doğrudan ilişkili.

    Bu model sistemi giren klinik çalışma öncesinde hasta doku geni teslimi ile ilgili değerli bilgiler sağlayacaktır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgements

    Bu çalışma, Cork Güney Revir Victoria Üniversitesi Hastanesi Göğüs fonu, İrlanda Kanser Derneği (CRI07TAN) ve Cork Kanser Araştırma Merkezi ile finanse edildi. CMV organizatörü transkripsiyonel kontrol altında çoğaltma beceriksiz rekombinant Adenovirüs 5 parçacıklar Glasgow Üniversitesi Prof. Andrew Baker, bir tür hediye edildi.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM Sigma-Aldrich D6429
    PBS Sigma-Aldrich D8537
    Firefly Luciferin Biosynth International, Inc
    Dermabond Johnson & Johnson
    Vibrotome Leica Microsystems VT 1000 A

    References

    1. van de Bovenkamp, M., Groothuis, G.M., Draaisma, A.L., Merema, M.T., Bezuijen, J.I., van Gils, M.J., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85(1):632-8 (2005).
    2. Speirs, V., Green, A.R., Walton, D.S., Kerin, M.J., Fox, J.N., Carleton, P.J., et al. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78(11):1421-9 (1998).
    3. Kirby, T.O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M., et al. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10(24):8697-703 (2004).
    4. Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M.C., Coll, J.L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14(22):1587-93 (2007).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter