Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

1. Isolamento dei linfociti ⁵

1. Isolare tumore-drenante linfonodi o milza di portatori di tumore FVBN202 topi transgenici e preparare sospensione singola cellula ghiacciato RPMI1640 supplementato con 10% FBS. B / I di attivazione in 50 ml in polipropilene risultati tubi conici in una maggiore produzione di cellule T rispetto ai tubi in polistirolo. Ketamina e xilazina vengono iniettati ip per l'anestesia. Dislocazione cervicale è utilizzato come metodo di eutanasia.
2. Coltura delle cellule (10 ⁶ cellule / ml) in terreno completo contenente 15% FBS con bryostatin-1 (5 nm) e ionomicina (1 mM) insieme a 80 U / mL di IL-2 (Peprotech) per 16 h.
3. Lavare le cellule tre volte con mezzo caldo (37 ° C) e la cultura a 10 ⁶ cellule / ml in terreno completo con IL-7 (10 ng / ml) e IL-15 (10 ng / ml) (Peprotech) per 24 ore .
4. Pulse le cellule con IL-2 (40 U / mL) per 24 h.
5. Dividere le celle e la cultura con IL-7 e IL-15 (10 ng / ml) per 4 giorni. Cambiamenti a medio e dividere le celle, se necessario, ogni 2 giorni.

2. Determinare espansione Fold delle cellule T dai conti cellulare e Citometria a flusso Analisi ⁵

1. Conta delle cellule al microscopio ottico
   1. Preparare la diluizione appropriata di cellule (1:100) in trypan blu e aggiungere alcuni microlitri su emocitometro
   2. Conte 9 quadrati e determinare il numero totale delle cellule dividendo conta delle cellule al numero di camere moltiplicato per il fattore di diluizione. I risultati saranno presenti numero x 10 ⁴ cellule / ml.
2. Determinare percentuale di CD8 + e cellule T CD4 + nelle cellule espanse mediante citometria di flusso
   1. Blocca legame non specifico degli anticorpi ai recettori Fc dalla coltura le cellule con anticorpi anti-CD16/CD32 (Biolegend) per 20 minuti in ghiaccio e poi lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS ghiacciato integrato con sodio azide 1% .
   2. Macchiare le cellule da coltura con FITC-CD4 e CD8 PE-anticorpi per 20 minuti in ghiaccio e poi lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS ghiacciato integrato con FBS 1% e sodio azide allo 0,1%.
   3. Fissare le cellule con 1% paraformaldeide ed eseguire campioni su un Beckman Coulter FC 500 e analizzare con la versione 4,3 vertice del software.

3. Determinare Tumore specificità del Vivo ex Expanded cellule T

1. Cultura della ex vivo ampliato linfociti in terreno completo con un rapporto 10:1 con irradiati neu positivo cellule tumorali MMC (15.000 rad) per 24 h. ⁵
2. Surnatanti raccolta e conservare a -80 ° C fino al momento. ^5,6
3. Rileva IFN-γ utilizzando un mouse IFN-γ ELISA set (BD Pharmingen) secondo il protocollo del produttore. ^5,6

4. Determinare antitumorale Funzione dell'ex Vivo Expanded cellule T ^5,6

1. Incubare cellule T con le cellule tumorali in un effettore 10:01: rapporti bersaglio per 48 ore in terreno completo a 3 ml di mezzo completo (RPMI-1640 integrato con 100 U / mL di penicillina, 100μg / ml streptomicina, 10% FBS, glutammina e β - mercaptoetanolo) e 20U / mL di IL-2 (Peprotech) in 6 piatti cultura ben 37 ° C / 5% di CO _2.
2. Eseguire tre macchie di colore per gli anticorpi neu (anti-c-Erb2/c-neu, clone-4, Calbiochem) seguito da PE-anti IgG di topo, annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI), secondo il protocollo del produttore (BD Pharmingen)
3. Porta sulle cellule tumorali neu positivo e analizzare la vitalità (annessina V-/PI-) delle cellule tumorali

5. Modello murino di cancro al seno

FVBN202 topi transgenici femminile (Charles River Laboratories) può essere utilizzato per la fonte del tumore cellule T reattive. Questi topi iperespressione di uno disattivo ratto neu transgene sotto il controllo del promotore MMTV e di conseguenza lo sviluppo spontaneo di carcinoma mammario tra i 4-10 mesi di età ^7. Questi topi sviluppano premaligne iperplasia mammaria simile al carcinoma duttale in situ (DCIS) prima dello sviluppo della spontanea carcinoma8. Spontanea del tumore-cuscinetto topi sono usati come donatori di cellule T.

6. Rappresentante dei risultati:

Attivazione delle cellule T con B / I per 16 ore in risultati uccisione di cellule T naive che non sono sensibilizzati con il tumore in vivo. Dopo la B / I selettività di tumore cellule T reattive si espandono fino a 2,8 volte all'interno di un 6 giorni di cultura con citochine catena gamma (Figura 1). Entrambi i CD8 + e cellule T CD4 + sono ugualmente ampliata con citochine catena gamma (Figura 2). L'ex-vivo delle cellule T espanse mostrare reattività alta contro i tumori che i topi sono stati sensibilizzati al donatore, come valutato dalla produzione di IFN-γ in presenza di carcinoma mammario positivo del mouse neu (MMC), le cellule tumorali (Figura 3). L'ex vivo delle cellule T espanse può indurre l'apoptosi in positivo tumore cel neu MMCls tale che la vitalità delle cellule tumorali scende dal 92% al 61% entro 48 ore (Figura 4).

Figura 1. Fold espansione dei linfociti in diversi momenti seguenti B / I di attivazione (giorno 1) ed espansione ex vivo con citochine catena gamma (giorni 3, 5 e 7)

Figura 2. Percentuale totale di cellule CD4 + e CD8 + T prima e dopo 7 giorni di espansione con citochine catena di gamma.

Figura 3. Tumore stimolata la produzione di IFN-γ da parte delle cellule T isolate da topi portatori di tumore prima e dopo 7 giorni di espansione con citochine catena di gamma, con IFN-γ ELISA

Figura 4. Citotossici funzione della ex vivo delle cellule T espanse con citochine catena gamma del mouse neu contro il carcinoma mammario positivo (MMC), le cellule tumorali

Espansione selettiva del tumore-reattiva cellule T effettrici con funzione anti-tumorale può essere ottenuto utilizzando il protocollo proposto B / I di attivazione ed espansione ex vivo con citochine catena gamma di IL-2, IL-7 e IL-15. Mentre IL-2 è un fattore di crescita delle cellule T in grado di supportare la differenziazione e l'espansione di antigene-specifiche cellule T, IL-7 in grado di inibire l'apoptosi delle cellule T e sostenere la loro vitalità durante l'espansione. IL-15 può supportare le cellule T memoria che sono importanti per la generazione di lunga durata anti-tumore risposte sulla terapia cellulare adottiva T ^9-11. Cambiando l'ordine e la combinazione di queste citochine potrebbero influenzare la differenziazione delle cellule T espanse che a loro volta possono migliorare o ridurre il loro anti-tumorali ¹² efficacia. Il protocollo proposto non richiede l'identificazione di antigeni tumorali. Espansione selettiva del tumore cellule T reattive risultati nella produzione di un numero elevato di anti-tumorale delle cellule T che possono essere utilizzati per la terapia cellulare adottiva T dei pazienti oncologici. Abbiamo precedentemente dimostrato che la ex vivo delle cellule T espanse animali protetti contro il cancro al seno dopo la terapia cellulare adottiva T.