Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

1. Isolatie van Lymfocyten ⁵

1. Isoleer tumor-drainerende lymfeklieren of milt van tumor-dragende FVBN202 transgene muizen en voor te bereiden enkele celsuspensie in ijskoud RPMI1640 aangevuld met 10% FBS. B / I activering in 50 ml polypropyleen conische buizen resulteert in een grotere T-cel-opbrengst in vergelijking met polystyreen buizen. Ketamine en xylazine worden geïnjecteerd ip voor anesthesie. Cervicale dislocatie wordt gebruikt als een methode van euthanasie.
2. Cultuur van de cellen (10 ⁶ cellen / ml) in volledig medium dat 15% FBS met bryostatin-1 (5 nM) en ionomycine (1 uM), samen met 80 U / ml IL-2 (Peprotech) voor 16 uur
3. Was de cellen drie keer met warm medium (37 ° C) en cultuur bij 10 ⁶ cellen / ml in compleet medium met IL-7 (10 ng / ml) en IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) voor 24 uur .
4. Puls van de cellen met IL-2 (40 U / ml) gedurende 24 uur
5. Splitsen van de cellen en de cultuur hen met IL-7 en IL-15 (10 ng / mL) voor 4 dagen. Verandering medium en splitsen de cellen als dat nodig is om de 2 dagen.

2. Bepaal Vouw Uitbreiding van T-cellen door de cel-tellingen en flowcytometrie-analyse ⁵

1. Celtellingen door lichtmicroscopie
   1. Bereid juiste cel verdunning (1:100) in trypan blauw en voeg enkele uL op hemocytometer
   2. Count 9 pleinen en het vaststellen van totaal aantal cellen door deling van cellen telt het aantal kamers vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. De resultaten zullen presenteren aantal x 10 ⁴ cellen / ml.
2. Te bepalen deel van de CD8 + en CD4 + T-cellen in de uitgebreide cellen door flowcytometrie
   1. Blokkeer niet-specifieke binding van antistoffen tegen Fc-receptoren door het kweken van de cellen met anti-CD16/CD32 antilichaam (Biolegend) gedurende 20 min op ijs en spoel daarna de cellen twee keer met 2 ml ijskoud PBS aangevuld met 1% natriumazide .
   2. Vlekken op de cellen door het kweken met FITC-CD4-en CD8-PE-antilichamen gedurende 20 min op ijs en spoel daarna de cellen twee keer met 2 ml ijskoud PBS aangevuld met 1% FBS en 0,1% natriumazide.
   3. Fixeer de cellen met 1% paraformaldehyde en lopen monsters op een Beckman Coulter FC 500 en analyseren met behulp van Summit versie 4.3 software.

3. Bepaal Tumor-specifieke karakter van de ex vivo Expanded T-cellen

1. Cultuur van de ex vivo lymfocyten in compleet medium uitgebreid op een 10:01 verhouding met bestraalde neu positieve MMC tumorcellen (15.000 rad) gedurende 24 uur ⁵
2. Oogst supernatants en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. ^5,6
3. IFN-γ te detecteren met behulp van een IFN-γ muis ELISA Set (BD Pharmingen) volgens protocol van de fabrikant. ^5,6

4. Bepaal Anti-tumor Functie van de ex vivo Expanded T-cellen ^5,6

1. Incubeer de T-cellen met tumorcellen in een 10:01 effector: doel ratio's voor 48 uur in compleet medium op 3 ml compleet medium (RPMI-1640 aangevuld met 100 E / ml penicilline, 100μg / ml streptomycine, 10% FBS, glutamine en β - mercaptoethanol) en 20U / ml IL-2 (Peprotech) in zes goed cultuur gerechten 37 ° C / 5% CO _2.
2. Voer drie kleuren antilichaam kleuring voor neu (anti-c-Erb2/c-neu, kloon-4, Calbiochem), gevolgd door PE-anti-muis IgG, Annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) volgens protocol van de fabrikant (BD Pharmingen)
3. Gate op neu positieve tumorcellen en analyseren van levensvatbaarheid (Annexine V-/PI-) van de tumorcellen

5. Muis model van de Borstkanker

FVBN202 transgene vrouwelijke muizen (Charles River Laboratories) kan worden gebruikt voor de bron van tumor-reactieve T-cellen. Deze muizen overexpressie van een niet-geactiveerde rat neu transgen onder de regulatie van MMTV promotor en als gevolg daarvan de ontwikkeling van spontane mammacarcinoom tussen 4-10 maanden leeftijd van ^7. Deze muizen ontwikkelen premaligne hyperplasie borstklieren vergelijkbaar met ductaal carcinoma in situ (DCIS) voorafgaand aan de ontwikkeling van spontane carcinoma8. Spontane tumor-dragende muizen worden gebruikt als donoren van T-cellen.

6. Representatieve resultaten:

Activatie van T-cellen met B / I gedurende 16 uur resulteert in het doden van naïeve T-cellen die niet zijn gesensibiliseerd met de tumor in vivo. Na het B / I selectiviteit van tumor-reactieve T-cellen ze tot 2,8-voudig uit te breiden in een 6-daagse cultuur met de gamma-keten cytokines (figuur 1). Zowel de CD8 + en CD4 + T-cellen zijn even uitgebreid met de gamma-keten cytokines (figuur 2). De ex vivo-geëxpandeerde T-cellen vertonen een hoge responsiviteit ten opzichte van de tumoren die donor muizen werden gesensibiliseerd om, zoals geëvalueerd door de productie van IFN-γ in de aanwezigheid van neu positieve muis mammacarcinoom (MMC) tumorcellen (figuur 3). De ex vivo geëxpandeerde T-cellen kan induceren apoptose in de neu positieve MMC tumor cells zodanig dat levensvatbaarheid van de tumorcellen daalt van 92% tot 61% binnen 48 uur (figuur 4).

Figuur 1. Fold uitbreiding van de lymfocyten op verschillende tijdstippen na B / I activering (dag 1) en ex vivo expansie met de gamma-keten cytokines (dag 3, 5 en 7)

Figuur 2. Totaal percentage van CD4 + en CD8 + T-cellen voor en na een 7-daagse uitbreiding met de gamma-keten cytokines.

Figuur 3. Tumor-IFN-γ gestimuleerd productie door T-cellen geïsoleerd uit tumor-dragende muizen voorafgaand aan en na een 7-daagse uitbreiding met de gamma-keten cytokines, met behulp van IFN-γ ELISA

Figuur 4. Cytotoxische functie van de ex vivo uitgebreid T-cellen met de gamma-keten cytokines tegen neu positieve muis mammacarcinoom (MMC) tumorcellen

Selectieve uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen met effector anti-tumor-functie kan worden bereikt door het voorgestelde protocol met behulp van B / I-activering en ex vivo expansie met de gamma-keten cytokines IL-2, IL-7 en IL-15. Terwijl de IL-2 is een T-cel groeifactor die de differentiatie en uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen kan ondersteunen, kan IL-7 remmen apoptose van T-cellen en ondersteuning van hun levensvatbaarheid tijdens de expansie. IL-15 kan ondersteunen geheugen T-cellen die belangrijk zijn voor het genereren van langdurige anti-tumor responsen op adoptieve T cel-therapie ^9-11. Het veranderen van de volgorde en de combinatie van deze cytokines invloed kunnen zijn op de differentiatie van de uitgebreide T-cellen die op hun beurt kunnen verbeteren of vermindering van hun anti-tumor werking ^12. De voorgestelde protocol zal niet vereist dat de identificatie van tumor antigenen. Selectieve uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen resulteert in de productie van grote aantallen van anti-tumor T-cellen die kunnen worden gebruikt voor de adoptieve T cel-therapie van kankerpatiënten. We hebben eerder aangetoond dat de ex vivo geëxpandeerde T cellen beschermde dieren tegen borstkanker volgende adoptieve T cel-therapie.