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 JoVE Immunology and Infection

前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

1, 2, 3, 3, 1

1Department of Microbiology & Immunology, Virginia Commonwealth University- Massey Cancer Center, 2Department of Internal Medicine, Virginia Commonwealth University- Massey Cancer Center, 3Department of Surgery, Virginia Commonwealth University- Massey Cancer Center

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Cite this Article: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

Abstract: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

据报道，乳腺癌患者既存的免疫反应，对他们的肿瘤1,2。然而，这种免疫反应，未能提供完整的保护，对发展或复发的乳腺癌。为了克服这个问题，通过增加肿瘤反应性T细胞的频率，过继免疫治疗已聘用。扩大肿瘤特异性T细胞已被用于多种协议。然而，这些协议限制的肿瘤抗原体外抗原特异性T细胞的活化使用。最近，常见的伽玛链细胞因子如IL - 2，IL - 7，IL - 15和IL - 21已单独或联合使用的抗肿瘤免疫反应的3的增强。不过，目前尚不清楚制定工作，为扩大肿瘤反应性T细胞的最佳。在这里，我们提出了一个从FVBN202在收养的T细胞治疗乳腺癌HER-2/neu的阳性乳腺癌的转基因小鼠模型的肿瘤反应性T细胞的选择性激活和扩张的协议。该协议包括bryostatin-1/ionomycin（B / I）和IL - 2激活T细胞，在16个小时的肿瘤抗原的情况下。 /我的激活模仿细胞内的信号，导致T细胞的活化蛋白激酶C活性和细胞内钙离子增加， 分别为4。该协议具体激活肿瘤特异性T细胞，而造成不相关的T细胞。与IL - 7和IL - 15的B /我激活T细胞培养24小时，然后用IL - 2脉冲。 24小时后，T细胞被洗净，分割，并培养与IL - 7 + IL - 15增加4天。 前体外扩增的T细胞特异性肿瘤和抗肿瘤疗效是确定的。

Protocol: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

1。分离淋巴细胞5

  1. 分离肿瘤引流淋巴结或荷瘤FVBN202转基因小鼠的脾脏和单细胞悬液，准备在冰冷的RPMI1640含10％胎牛血清的补充。 /我在激活50毫升聚丙烯锥形管，结果在一个更大的T细胞产量相比，聚苯乙烯管。氯胺酮和甲苯噻嗪注射麻醉IP。颈椎脱位是用来作为一个“安乐死”的方法。
  2. 文化在完全培养基中的细胞（10 6细胞/ mL）bryostatin - 1（5纳米）和离子霉素（1μM）80 U / mL的IL - 2（Peprotech）含15％胎牛血清的16小时
  3. 清洗细胞与温暖的培养基（37℃）和文化与IL - 7（10毫微克/毫升）和IL - 15（10毫微克/毫升）（Peprotech）10 6细胞/ mL的完全培养基24小时的三倍。
  4. 脉冲的细胞与IL - 2（40 U / mL）的24小时
  5. 拆分与IL - 7和IL - 15细胞和文化，他们多为4天（10毫微克/毫升）。更改介质和细胞分裂，如果需要的话，每2天。

2。确定T细胞的细胞计数和流式细胞仪分析5折的扩展

  1. 通过光镜细胞计数
    1. 准备在适当的细胞台盼蓝稀释液（1:100），并添加到血球数微升
    2. 共9平方，并确定数乘以稀释倍数商会除以细胞计数细胞总数。结果将目前的数量× 10 4细胞/ ml。
  2. CD8 +和CD4 + T细胞的比例确定在流式细胞仪检测扩增细胞
    1. 座与anti-CD16/CD32抗体（Biolegend）非特异性结合的抗体通过培养Fc受体的细胞在冰上20分钟，然后洗细胞两次2毫升冰冷的PBS辅以1％的叠氮化钠。
    2. 培养FITC标记的CD4和冰20分钟的PE - CD8抗体染色的细胞，然后洗细胞两次2毫升1％FBS和0.1％的叠氮化钠的补充冰冷的PBS。
    3. 1％多聚甲醛固定细胞和运行在贝克曼FC 500的样本，并分析首脑会议4.3版软件。

3。确定体内的肿瘤特异性T细胞膨胀

  1. 文化体外扩大在辐照神经阳性MMC肿瘤细胞比例为10:1（15000 RAD）完全培养基中的淋巴细胞为 5小时24
  2. 收获上清和存放在-80℃直至使用。5,6
  3. 检测干扰素-γ使用小鼠IFN -γELISA法设置（BD Pharmingen公司）根据制造商的协议5,6。

4。确定抗肿瘤功能的前体外扩增的T 细胞 5,6

  1. 孵育T细胞与肿瘤细胞的效应：一个10:1的完全培养基中48小时的目标，在3 mL的完全培养基（RPMI - 1640 100U /毫升的青霉素，100μg/ mL链霉素，10％胎牛血清，谷氨酰胺和β为辅比率-巯基乙醇）和20U / mL的IL - 2在6孔培养皿中37 ° C / 5％的CO 2（Peprotech）。
  2. 执行三色为中性抗体染色（anti-c-Erb2/c-neu，克隆- 4，Calbiochem），其次是PE抗鼠IgG，膜联蛋白V - FITC和碘化丙啶（PI）根据制造商的协议（BD Pharmingen公司）
  3. 神经阳性肿瘤细胞的门和分析的可行性（膜联蛋白V-/PI-）的肿瘤细胞

5。乳腺癌的小鼠模型

FVBN202转基因雌性小鼠（Charles River实验室），可用于肿瘤反应性T细胞的来源。这些小鼠MMTV启动子调控下的一个激活的大鼠神经转基因过度表达，因此开发4-10岁7个月之间的自发乳腺癌。这些小鼠癌前病变的乳腺增生，导管原位癌（DCIS）前自发carcinoma8发展。自发荷瘤小鼠的T细胞的捐助者。

6。代表性的成果：

激活T细胞与B /第一天真不与体内肿瘤致敏的T细胞杀死了16个小时。之后的B /我的选择性的肿瘤反应性T细胞，他们扩大了在为期6天的的文化与γ链细胞因子（图1）的2.8倍。 CD8 +和CD4 + T细胞也同样扩大与γ链细胞因子（图2）。 体外扩大T细胞对肿瘤的高响应，供体鼠敏感地认识到，作为评估所生产的干扰素γ神经积极小鼠乳腺癌（MMC）（图3）肿瘤细胞的存在。扩大体内的T细胞可以诱导细胞凋亡在神经积极MMC肿瘤CELLS这样的肿瘤细胞的可行性，从92％下降到61％在48小时内（图4）。

失踪图
图1。折扩张在不同时间点淋巴细胞，激活B / I（1天）和γ链细胞因子体外扩增（3，5，7天）

失踪图
图2，前后7天的扩张与γ链细胞因子的CD4 +和CD8 + T细胞的总百分比。

失踪图
肿瘤刺激IFN -γ的生产从荷瘤小鼠与γ链细胞因子的扩大7天之前和之后中分离出的T细胞，用IFN -γELISA法图3。

失踪图
图4扩大与γ链细胞因子对神经积极的小鼠乳腺癌（MMC）肿瘤细胞的T 细胞的体外细胞毒性作用。

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Discussion: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

肿瘤反应性T细胞的选择性扩张效应的抗肿瘤作用，可建议使用B协议实现/我的激活和γ链细胞因子IL - 2，IL - 7和IL - 15的体外扩增。 IL - 2是T细胞的生长因子，可支持抗原特异性T细胞的分化和扩张，而IL - 7可以抑制T细胞的凋亡，并支持在扩张他们的生存能力。 IL - 15可以支持，收养T细胞治疗9-11后产生长期的抗肿瘤反应的重要的记忆性T细胞。改变这些细胞因子的顺序和组合，可能影响扩大T细胞，这反过来又可能提高或降低其抗肿瘤疗效12的分化。拟议的协议将不会需要鉴定的肿瘤抗原。选择性扩张肿瘤反应性T细胞可以收养T细胞治疗的癌症患者使用的抗肿瘤T细胞高的生产结果。我们曾表明， 前体外扩增的T细胞对乳腺癌的保护动物收养T细胞疗法。

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Disclosures: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

这项工作是由美国国立卫生研究院R01 CA104757格兰特（MH Manjili）的支持。我们非常感谢VCU梅西癌症中心的支持和英联邦基金会为癌症研究。

Materials: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

Name Company Catalog Number Comments
Bryostatin 1 Sigma-Aldrich B7431-10ug
Ionomycin Calbiochem 407950
Mouse IL-7 PeproTech Inc 217-17
Mouse IL-15 PeproTech Inc 210-15
Human IL-2 PeproTech Inc 200-02
RPMI1640 Invitrogen 11875
FBS Gemini Bio Products 100-106
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
L- glutamine Invitrogen 25030081
β- mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
anti-CD16/32 antibody Biolegend 101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit BD Biosciences 556547
FITC-CD4 Biolegend 100406
PE-CD8 Biolegend 100708
anti-c-Erb2/cNeu Calbiochem OP16
PE- anti mouse IgG Biolegend 405307
formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Hemocytometer Hycor 87144
Light microscope VWR international V200073
Mouse IFN-γ ELISA set BD Biosciences 555138
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175

References: 前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

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