Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

1. Verlamming van de spin en het isolement van de buik

1. Overdracht van de spin van een glazen pot in een kartonnen doos bekleed met kunststof (Figuur 1A). We meestal verzamelen spinnen uit houtstapels, garages of struiken en het huis ze in het lab in glazen potten. Omdat de spin niet kan beklimmen de kunststof bekleding, biedt een efficiënte methode om de spin transfer van een glazen pot of koffie kan in een kleiner flesje voor verlamming doeleinden. Terwijl de behandeling van de spin op dit punt, moet je het dragen van twee paar latex handschoenen of tuinhandschoenen voor veiligheidsdoeleinden.
2. Terwijl de spin is in de doos bekleed met plastic, aanpak van de spin van zijn achterkant en laat de spin glijden in de plastic flacon cultuur. Na de spin komt in de flacon, onmiddellijk plaats de plug over de top (figuur 1B). Wij raden u aan een flesje, dat is ongeveer 101,6 mm x 31,75 mm (L x D). Dit minimaliseert de hoeveelheid koolstofdioxide gas nodig is voor de verlamming stap.
3. Verdoven de spin door de invoering van koolstofdioxide gas op 5-10 pond per vierkante inch voor 10 min (figuur 1C). Deze hoeveelheid gas zal alleen kloppen de spin uit voor ongeveer 5 minuten, dus na verdoving dient u onmiddellijk verder met de stappen 1,4-1,5.
4. Plaats de verdoofde spin in een kleine dissectie schotel en een tang om de spin dorsale zijde naar boven (rood zandloper naar beneden gericht) positie.
5. Clip hoogte van de taille (smalle steel het aansluiten van de kopborststuk en de buik) om de buik los van de rest van de spin (figuur 1D). Bewaar de cephalothorax in de vriezer 's nachts in een petrischaal en gooi na bevroren de volgende dag. Wees voorzichtig bij het verplaatsen van de cephalothorax als de tanden van de spin zijn aanwezig op dit segment.
6. Bevestig de buik om de Sylgard materiaal in de kleine dissectie schotel met een enkele insect pin. Steek het insect pen door het gat gemaakt van clipping hoogte van de taille (figuur 1E). Dit kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als de plaats waar de vloeistof die uit het knippen van de hoogte van de taille. Zorg ervoor dat de spindop (tegenover het einde van de hoogte van de taille) gericht is in de richting van de onderkant (het dichtst bij je).

2. Verwijdering van het exoskelet

1. Maak de eerste incisie door het exoskelet met behulp van een paar microscissors, te beginnen bij de opening van het steeltje clipping. Snijd zijwaarts tot de dorsale zijde is bereikt aan beide zijden (Figuur 1F). Met behulp van een pincet, schil de rug van de voorste exoskeleton segment en voegt u een tweede pin op deze locatie. Na het inbrengen van de tweede pin, draait u de lade ontleden caudaal (90 ° hoek) van de initiële laterale snijdt en verder te snijden totdat de spintepels zijn bereikt (figuur 1G). Deze incisie wordt loodrecht of verticaal worden de eerste laterale snijden. Niet snijden door de spintepels als de verticale incisie wordt gemaakt (posterior ten opzichte van de zandloper en het heeft een ronde uiterlijk). Als de tweede pin te voegen zal resulteren in de buik draaien wanneer de verticale incisies worden uitgevoerd.
2. Dompel de buik in ontleden bufferoplossing (0.1 M natriumchloride, 0,015 M natriumcitraat, 0,1% Diethyl Pyrocarbonate).
3. Schil de resterende exoskelet terug vanaf het beginstadium, laterale incisie. Wanneer dit is voltooid, moet het vetweefsel duidelijk zichtbaar zijn (Figuur 1H).

3. Isolatie van de zijde-producerende klieren

1. Met behulp van een tang beginnen plagen weg de vetlaag (Figuur 1H). Het vet heeft een witachtig tot geelachtig uiterlijk. Ga verder tot het grootste deel van het vet wordt verwijderd en de zijde klieren zijn duidelijk zichtbaar. De tubuliform klier bestaat uit drie paar zeer lange, cilindrische buizen die zijn er in overvloed in de buikholte. De belangrijkste ampullate, die is gevonden in paren, is een grote, halvemaanvormige ampulla met een lange ingewikkelde distaal staart en een proximale kanaal dat de dalingen in de breedte bij het naderen van de spin spintepels. De minor ampullate is zeer vergelijkbaar in morfologie op de grote ampullate, maar het is beduidend kleiner. De flagelliform klier, zich ook voor in paren, is rond en multilobular met een kleine cilindrische zig-zag kanaal die naar beneden uitstrekt in de richting van de spintepels. De totale klier (te vinden in paren) is een zeer grote, multilobular klier die een zeer grote uitscheidingsorganen kanaal die grote, onregelmatige lobben heeft op heeft. De aciniform klieren komen in grote aantallen en lijken op korte, kleine vingervormige uitsteeksels. De peervormig klier is de kleinste klier in de buik en heeft vele verdicht, cilindrische buizen die lijken op een ventilator met veel kleine uitscheidingsorganen buizen die naar beneden uit te breiden tot de spintepels.
2. We raden aan het verwijderen van de klieren in de volgende volgorde: tubuliform, grote ampullate, flagelliform, kleine ampullate, aggregaat, aciniform, en vervolgens de peervormig (Figuur 2A-B).
3. Beginnend met de tubuliform, plagen deze klieren af ​​van de rest van ee klieren - ze moeten zitten op de top van de andere klieren (Figuur 2A). Er zijn drie paren van tubuliform klieren in een spin. Laat ze drijven vrij, maar gehecht aan hun spintepels blijven door hun kabelgoten.
4. Vervolgens plagen weg de belangrijkste ampullate klieren. Er zijn twee belangrijke ampullate klieren aanwezig zijn in een spin. Tijdens de verhuizing procedure, zorg ervoor dat de leidingen blijft vastzitten aan het klieren (Figuur 2A).
5. Ga verder naar de rest van de klieren plagen uit de buurt van elkaar, zorgvuldig werken om te voorkomen dat doorprikken een van de klieren, vooral de aggregaat en flagelliform klieren. Elke klier moet vrij zwevende helemaal aan haar punt van uitgang in het exoskelet van de spintepels. Deze klieren worden ook gevonden in paren. Verwijder elke klier door knijpen de buis met een tang en zorgvuldig te trekken tot het breekt uit de buurt van de uitgang. De belangrijkste ampullate, flagelliform, kleine ampullate, en geaggregeerde klieren zijn te vinden in paren. De aciniform en peervormig klieren komen in veel meer paren.
6. Verwijder elke klier door knijpen de buis met een tang en zorgvuldig te trekken tot het breekt uit de buurt van de uitgang door de spindop. We meestal slaan de klieren nat, maar wij niet toe te voegen extra buffer.
7. Omdat de klieren zijn verwijderd, plaats ze in steriele gelabelde 1,5 ml microcentrifuge buizen. Individuele klieren worden weergegeven in Figuur 3A-G. Houd deze klieren op ijs en dan flitsen ze invriezen in vloeibare stikstof. Na de flits bevriezen in vloeibare stikstof, plaats ze bij -80 ° C voor opslag.

4. Representatieve resultaten

Bij het verwijderen van de verschillende klieren, moet uiterste zorg worden genomen tijdens het hanteren van de flagelliform en aggregeren klieren, omdat deze twee structuren kunnen eenvoudig worden doorboord en beschadigde met de tang. Verder is het vermeldenswaard dat morfologisch de flagelliform en aggregeren klieren erg lijken voorafgaand aan hun verwijdering en ze zijn vaak met elkaar verweven. Om te voorkomen dat kruisbesmetting van deze weefsels na verwijdering, moet de dissector zorgvuldig te plagen deze structuren uit elkaar. Daarnaast, op de eerste blootstelling van de zijde-producerende klieren, zal de aciniform en peervormig klieren het meest moeilijk om direct te visualiseren door hun kleinere omvang en de anatomische locatie. Vaak is er de aanwezigheid van vele eieren. Bovendien, extra zorg moet worden genomen bij het verwijderen van de klier peervormig, omdat dit weefsel is zeer kleverig en zal vaak voldoen aan uw tang. Wanneer deze procedure correct is uitgevoerd, is het mogelijk om alle zeven zijde-producerende klieren te verkrijgen van een spin in een sterk gezuiverd manier. Normaal gesproken kan men herstellen microgram totale hoeveelheid RNA en eiwit uit een enkele spin dissectie. Een voorbeeld van het gebruik van het totale RNA voor qPCR om de mRNA niveaus van een tubuliform beperkte fibroin gen, TuSp1 te onderzoeken, wordt weergegeven (figuur 4). Vertegenwoordiger van experimenten die betrekking eiwit lysaten verzameld uit de klieren bijvoorbeeld in-oplossing tryptische spijsvertering, gevolgd door MS-analyse (kan ook worden gebruikt voor MS / MS-analyse) of een aminozuursamenstelling analyse wordt getoond (Figuur 5-6, respectievelijk).

Figuur 1. Handling, verlamming, en verwijdering van het exoskelet uit de buik van een vrouwelijke zwarte weduwe spin. A) Overdracht van de spin in een kartonnen doos bekleed met plastic om te vergemakkelijken het verplaatsen van de spin in een kleiner plastic flacon. B) Spider geplaatst in een plastic flacon met stekker. C) verlamming van de spin met kooldioxide gas. D) Scheiding van het kopborststuk van de buik met behulp van microscissors. E) Immobilisatie van de buik in het ontleden lade met behulp van insecten pinnen. F) Bekijk na een laterale incisie gemaakt met de schaar en een gedeelte van het exoskelet is terug gepeld met een pincet. G) Incisies loodrecht in de oorspronkelijke laterale snijden. H) Afschaffing van het exoskelet en de blootstelling van de vetlaag.

Figuur 2. Visualisatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren, terwijl intact in de buik van de spin en omliggende weefsels. A) Beelden van de tubuliform, grote ampullate, flagelliform, aggregaat, kleine ampullate weefsels bij 12X vergroting. B) Afbeelding van de aciniform en peervormig klieren bij 12X vergroting.

Figuur 3. Foto's van de zeven zijde-producerende klieren na hun verwijdering uit de buik. Alle beelden werden opgenomen met een vergroting van 20x, met uitzondering van de aciniform en peervormig klieren, die werden gedaan op 40X. A) belangrijkeampullate klier, B), grote en kleine ampullate (rechts) voor grootte vergelijking; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregaat; F) aciniform; G) peervormig.

Figuur 4. Vertegenwoordiger resultaten van de expressie patroon van de zijde gen, TuSp1, na inventarisatie van de TuSp1 mRNA niveaus in de verschillende zijde-producerende klieren (exclusief de peervormig klier) met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) na isolatie van totaal RNA van de klieren.

Figuur 5. Voorbeeld van MS analyse van eiwitextracten verkregen uit de peervormig klier volgende in-oplossing tryptische spijsvertering. Let op: x2 staat voor 2-voudige vergroting van het spectrum intensiteit. Spectrum peptide ion massa's die overeenkomen met de regio's van de PySp1 fibroin worden weergegeven met het symbool #.

Figuur 6. Typisch resultaat van de aminozuursamenstelling profiel van de eiwitten uit de tubuliform klier. Let op: ASX = Asp en Asn; GLX = Glu en Gin. Blauwe kleur geeft aminozuren met polaire zijketen groepen dat de rode kleur staat voor aminozuurresten met niet-polaire zijketen groepen.

Onze methodologie voor de microdissectie van de zijde-producerende klieren van de zwarte weduwe spin biedt een effectief middel om zeer zuivere zijde-producerende klieren te verkrijgen. Dissecties kan worden voltooid in 1,5 tot 3 uur, waardoor een complete set van de zeven verschillende zijde-producerende klieren van cobweavers. Het verkrijgen van zeer zuivere zijde-klier samples maakt onderzoekers de mogelijkheid om een ​​breed scala van biochemische studies, waaronder de identificatie van nieuwe zijde of chaperonne-eiwitten opgeslagen in de klieren luminale inhoud met behulp van massaspectrometrie, een analyse van mRNA niveaus voor genen selectief uitgedrukt in verschillende klieren uit te voeren , en het kweken van specifieke klieren in vitro om het mechanisme van de zijdeproductie te bestuderen.