Pseudomonas और प्रवाह कक्ष में Saccharomyces cerevisiae Biofilm aeruginosa

Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells. J. Vis. Exp. (47), e2383, doi:10.3791/2383 (2011).

कई माइक्रोबियल कोशिकाओं बिना डंठल माइक्रोबियल biofilms कि गुण शारीरिक और रोग मुक्त रहने वाले सूक्ष्मजीवों की तुलना में बदल दिया है के रूप में परिभाषित समुदायों फार्म करने की क्षमता है. प्रकृति में Biofilms अक्सर जांच करने के लिए और ^खराब परिभाषित 1 शर्तों के अधीन रहते हैं मुश्किल है. एक पारदर्शी बुनियाद का उपयोग करना यह संभव है कि डिवाइस के लिए एक प्रणाली है जहां सरल biofilms वास्तविक समय में एक गैर विनाशकारी रास्ता में जांच की जा सकती है: यहाँ हम इन विट्रो 3 डी अध्ययन में माइक्रोबियल biofilms के लिए विधानसभा और एक प्रवाह सेल मॉडल प्रणाली के आपरेशन प्रदर्शन अच्छी तरह से परिभाषित ^2,3 शर्तों के तहत उच्च reproducibility सृजन.

कि biofilm के लिए विकास चैम्बर के रूप में कार्य करता है एक प्रवाह सेल प्रणाली के होते हैं. प्रवाह सेल और एक मध्यम कुप्पी से पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के साथ एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से आपूर्ति की है और खर्च मध्यम बर्बादी कंटेनर में एकत्र किया जाता है. प्रवाह प्रणाली के इस पुराने प्रवाह चैम्बर में विकसित कोशिकाओं के कम से कम अशांति के साथ पोषक तत्वों जैसे एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन की एक सतत आपूर्ति की अनुमति देता है. इसके अलावा, प्रवाह कक्ष के भीतर प्रवाह की स्थिति के अध्ययन biofilm कतरनी तनाव को उजागर अनुमति देते हैं. एक बुलबुला टयूबिंग है जो अन्यथा प्रवाह कक्ष में biofilm संरचना को बाधित कर सकता से डिवाइस सीमीत हवा बुलबुले फँसाने.

प्रवाह सेल प्रणाली Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के साथ संगत है और जिससे माइक्रोबियल biofilms के विकास के बारे में 3 डी अत्यधिक विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं. Biofilm में कक्ष फ्लोरोसेंट जांच या CLSM विश्लेषण के साथ संगत प्रोटीन के साथ लेबल किया जा सकता है. यह ऑनलाइन दृश्य सक्षम बनाता है और विकासशील biofilm में niches के जांच की अनुमति देता है. माइक्रोबियल आपसी संबंध, antimicrobial एजेंटों या विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की जांच, कई प्रयोगात्मक setups कि प्रवाह सेल प्रणाली में जांच की जा सकता हैं.

1. फ्लो सेल प्रणाली के सभी घटकों के साथ विधानसभा

Autoclavable टयूबिंग, बुलबुला जाल, मध्यम / अपशिष्ट बोतल और प्रवाह के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है कोशिकाओं: इकट्ठे प्रवाह प्रणाली भी शामिल है. इन सभी भागों प्रयोगों के बीच reused किया जा सकता है.

चित्रा 1 प्रवाह सेल प्रणाली सेटअप (सेटअप के जरूरी घटकों). एक मध्यम बोतल, एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, बुलबुला जाल, प्रवाह सेल, बर्बादी की बोतल, और विभिन्न connectors के द्वारा परस्पर टयूबिंग के विविध वर्गों: प्रवाह सेल प्रणाली कई घटकों के होते हैं. चित्रा कृपया रूण Lyngklip द्वारा प्रदान की गई है.

2. फ्लो सेल की सभा

1. प्रवाह कक्ष (2a चित्रा) सिलिकॉन गोंद की पतली गलियों, एक सिरिंज (चित्रा 3) का उपयोग कर के साथ इलाज किया जाता है.
2. सिलिकॉन लाइनों (चित्रा 3) के शीर्ष पर एक आवरण पर्ची रखें. ग्लास कवर फिसल जाता पी. के लिए बुनियाद के रूप में उपयोग किया जाता है aeruginosa है जबकि पीवीसी कवर फिसल जाता है एस के लिए लागू कर रहे हैं cerevisiae biofilm.

चित्रा 2 प्रवाह सेल और बुलबुला ² जाल के योजनाबद्ध ड्राइंग. ) प्रवाह ख सेल) बुलबुला जाल, DTU सिस्टम्स बायोलॉजी के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया आयामों की विस्तृत वर्णन. जॉन Wiley एंड संस, Inc (DTU सिस्टम्स बायोलॉजी पूर्व Biocentrum हकदार था, के रूप में आकृति में चित्रित) की अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित

चित्रा 3 कांच बुनियाद की कुर्की के लिए सिलिकॉन गोंद आवेदन लाइनों का चित्रण . इंगित कवर कांच सिलिकॉन गोंद पर रखा गया है यह प्रवाह सेल करने के लिए देते हैं.

3. प्रवाह सेल मोड़ पर है और यह कवर पर्ची नीचे पक्ष के साथ एक फ्लैट सतह पर जगह. प्रवाह सेल की पीठ पर धीरे प्रेस प्रवाह कक्ष के आधार पर कवर पर्ची धक्का. प्रवाह सेल पर मुड़ें और क्षेत्रों है कि सिलिकॉन के द्वारा बंद नहीं कर रहे हैं के लिए निरीक्षण. एक सिरिंज की संभाल के कलपुर्जे (पिस्टन) एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है धीरे से गिलास और प्रवाह सेल के साथ प्रेस.

3. मध्यम बोतल

1. एक मध्यम बोतल में एक खिला सिलिकॉन ट्यूब (2 मिमी भीतरी व्यास) प्लेस और दूसरे छोर पर एक सीधे संबंधक डालें.
2. बोतल के लिए मध्यम जोड़ें (मध्यम सामग्री के लिए "मीडिया" पैराग्राफ को देखें)
   कवर संबंधक और धातु पन्नी के साथ बोतल और मध्यम आटोक्लेव. यकीन है कि आपूर्ति ट्यूब के अंत मध्यम बोतल या एक अपनाना प्रभाव में तरल स्तर से ऊपर तय हो गई है मध्यम बोतल खाली जब autoclaving हो सकता है.

4. बुलबुला जाल, फ्लो सेल और पम्प कनेक्ट

चित्र 1 में रूपरेखा के अनुसार सभी टयूबिंग इकट्ठा. हिस्सा है कि क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप जहां Marprene टयूबिंग लागू किया जाता है के माध्यम से चला जाता है के लिए छोड़कर सिलिकॉन टयूबिंग का उपयोग करें.

1. आदेश में सभी व्यक्तिगत प्रवाह कक्ष में मध्यम बोतल से ट्यूब को कनेक्ट करने के लिए, प्रयोग में लागू inlets के अपेक्षित संख्या में एक ट्यूब में विभाजित. फ़ीड ट्यूब से पंप में Marprene ट्यूबों के लिए कनेक्शन ट्यूबों के वांछनीय संख्या (1 चित्रा, टी संबंधक देखें) टी कनेक्टर्स का उपयोग करें. यह आम तौर पर प्रणाली भर ट्यूब और प्रवाह कोशिकाओं के इसी अनुक्रम क्रम में रखने के लिए, करने के लिए प्रणाली में दोष के मामले में घटकों की पहचान की सुविधा के लिए एक अच्छा विचार है.
2. प्रत्येक व्यक्ति खिला ट्यूब (व्यास में मिमी 2) कनेक्ट सीधे कनेक्टर्स का उपयोग कर पंप में ट्यूबों Marprene. एक बुलबुला जाल Marprene टयूबिंग (चित्रा 2b) मध्यवर्ती सिलिकॉन टयूबिंग (व्यास में 1 मिमी) के माध्यम से कनेक्ट. सुनिश्चित करें कि पंप बुलबुला जाल से tallest भाग में प्रवेश करने के लिए जुड़ा हुआ है बनाओ.
3. प्रवाह सेल इनलेट (व्यास में 1 मिमी) बुलबुला जाल के परिणामस्वरूप आउटलेट ट्यूब कनेक्ट करने के लिए, सुनिश्चित करें कि इन tubings की लंबाई प्रवाह सेल confocal खुर्दबीन (आमतौर पर 1 मीटर) के चरण के लिए स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है.
4. 5 एमएल सीरिंज बुलबुला जाल के शीर्ष पर रखें. उपयुक्त टोपी के साथ सबसे ऊपर बंद.
5. प्रवाह कक्ष के आउटलेट पर एक छोटी, लगभग 40 मिमी का टुकड़ा (व्यास में 1 मिमी), टयूबिंग कनेक्ट और सीधे संबंधक "को कम करने" उपयोग करने के लिए आवश्यक लंबाई की बर्बादी ट्यूब (व्यास में मिमी 2) देते हैं. बेकार ट्यूब बर्बाद कंटेनर में रखें.
6. महत्वपूर्ण बात, अपशिष्ट कंटेनर हमेशा प्रवाह कोशिकाओं के रूप में एक ही स्तर पर रखा होना चाहिए, कभी नहीं प्रवाह सेल के स्तर से नीचे हो. इसके अलावा, यकीन है कि बर्बाद टयूबिंग के अंत अपशिष्ट तरल की उम्मीद के स्तर से ऊपर तय हो गई है फ्लश करने के लिए वापस अपनाना प्रभाव के कारण से बचने जब प्रवाह कोशिकाओं से निपटने.

5. स्टरलाइज़ और प्रवाह प्रणाली वाशिंग

1. बुलबुला जाल टोपियां निकालें और उन्हें 70% इथेनॉल में जगह उन्हें बाँझ रखने के लिए.
2. उच्चतम पंप गति से चलाने के लिए 0.5% (v / v) पानी में सोडियम hypochlorite के साथ सिस्टम को भरने </ Li>
3. जब बुलबुला जाल पूरी तरह से भर रहे हैं पर वापस बुलबुला जाल टोपियां रखें.
4. प्रवाह कोशिकाओं को ठोकर प्रवाह चैम्बर में बुलबुले को दूर करने के लिए. ध्यान रखना नाजुक कांच कवर नुकसान नहीं.
5. प्रणाली 3-4 घंटे के लिए 3 एमएल / ज / चैनल (0.2 मिमी / s रैखिक प्रवाह की दर) की एक प्रवाह दर पर बाँझ की अनुमति दें.
6. प्रणाली सभी हाइपोक्लोराइट धोने 2-3 बार धोएं. बाँझ पानी के साथ सिस्टम को भरें और खाली है. बबल जाल प्रत्येक धोने के बीच पूरी तरह खाली होना चाहिए. यह हवा में पंप तक बुलबुला जाल को खाली किया गया है द्वारा किया जा सकता है. खाली करने के बाद, बुलबुला जाल से पहले प्रणाली refilling के टोपियां हटायें. टोपी बदलें बाद बुलबुला जाल पूरी तरह तरल के साथ भर दिया गया है. दोहराएँ के रूप में आवश्यक.
7. प्रणाली के माध्यम से रात भर में एक कम प्रवाह की दर (1-3 एमएल / / ज चैनल) पर बाँझ पानी या चलाने के अगले चरण पर जाएँ.
8. इनलेट मध्यम बोतल कनेक्ट और रात खत्म मध्यम के साथ तापमान जहां प्रयोग किया जाएगा प्रदर्शन पर कम प्रवाह की दर पर (3 एमएल / / ज चैनल) सिस्टम फ्लश. नोट: बुलबुला जाल पानी के लिए खाली किया जाना चाहिए पहले इस प्रणाली मध्यम से भरा है.

6. फ्लो सेल का टीका

1. संस्कृति से एक रात में एक वांछित ऑप्टिकल घनत्व को एक कमजोर पड़ने (पी. aeruginosa 0.001 जैसे _600nm आयुध डिपो और एस cerevisiae के लिए 0.1 ओवर ड्राफ्ट _600nm के लिए) बनाते हैं .
2. एक 27G सुई के साथ एक 0.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करने के लिए पर्याप्त inoculum लोड करने के लिए कक्ष को भरने के लिए. 250 μL प्रवाह इस काम में निर्दिष्ट आयामों वाले कक्षों (चित्रा 2, 40 x 4 मिमी x 1 मिमी) के लिए पर्याप्त है.
3. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप बंद करो.
4. सिलिकॉन टयूबिंग प्रवाह सेल वापस प्रणाली में प्रवाह को रोकने के लिए अग्रणी दबाना.
5. यह 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा सिलिकॉन टयूबिंग पर टीका साइट जीवाणुरहित.
6. सिलिकॉन ट्यूब में सुई डालें और प्रवाह सेल के इनलेट में टिप परिचय. धीरे धीरे चेंबर में inoculum इंजेक्षन (हवाई बुलबुले नहीं इंजेक्षन करने के लिए सावधान रहना).
7. सुई निकालें और 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट छेद के इंजेक्शन स्थल पर सिलिकॉन गोंद का उपयोग तत्काल सील द्वारा बाद पोंछ.
8. प्रवाह कक्ष पर मुड़ें और प्रवाह सेल के माध्यम से प्रवाह के बिना 1 घंटे के लिए सूक्ष्म जीवों बुनियाद के लिए पालन.
9. मुड़ें प्रवाह कक्ष, मध्यम पंप (3 एमएल / / ज चैनल) शुरू करने और सिलिकॉन ट्यूब बंद दबाना ले.
10. प्रणाली ऊष्मायन के लिए रखा गया है, 37 ° C पी. के मामले में aeruginosa और 30 डिग्री सेल्सियस एस के मामले में cerevisiae.
11. प्रवाह कक्षों में biofilm अब CLSM द्वारा visualized किया जा सकता है.

7. माइक्रोस्कोपी के लिए biofilm के धुंधला हो जाना

1. उपयुक्त धुंधला की एक कमजोर पड़ने (जैसे 1:1000 9 Syto एस cerevisiae के लिए दाग रहते हैं )
2. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप बंद करो.
3. सिलिकॉन टयूबिंग के प्रवाह कक्ष के लिए अग्रणी दबाना.
4. यह 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा सिलिकॉन टयूबिंग पर टीका साइट जीवाणुरहित.
5. एक 27G सुई के साथ एक 0.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करने के लिए पर्याप्त धुंधला समाधान लोड करने के लिए कक्ष को भरने के लिए. 250 μL प्रवाह यहां इस्तेमाल किया कक्षों के लिए पर्याप्त है.
6. सिलिकॉन ट्यूब में सुई डालें और प्रवाह सेल के इनलेट में टिप परिचय. धीरे धीरे चेंबर में धुंधला समाधान (बुलबुले नहीं इंजेक्षन करने के लिए सावधान रहना) इंजेक्षन.
7. सुई निकालें और 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट इंजेक्शन साइट के तत्काल सील द्वारा बाद पोंछ.
8. 15 मिनट के लिए प्रवाह के बिना प्रवाह सेल छोड़ो.
9. बंद घोड़े का अंसबंध लो और प्रवाह शुरू (3 एमएल / / ज चैनल)
10. CLSM के साथ डेटा का मोल

हम एक प्रवाह सेल प्रणाली है कि biofilm जांच में एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है प्रदर्शन किया है. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी इमेजिंग के साथ संयुक्त, प्रणाली और अधिक परंपरागत सूक्ष्म तकनीकों के माध्यम से माइक्रोबियल biofilms विश्लेषण के अन्य तरीकों की तुलना में लाभ की एक सीमा है. इस प्रणाली समुदाय की गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल biofilm समुदायों रहने के 3D दृश्य की अनुमति देता है. लाइट माइक्रोस्कोपी biofilm के niches के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करता है और जबकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी biofilm के nanoscale संकल्प प्रदान करता है, यह जीना सेल इमेजिंग की अनुमति नहीं है.

वर्णित प्रवाह चैनल सिस्टम हम पहले बैक्टीरियल कोशिकाओं कई ^08/05 (चित्रा 4a) एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशील, कोशिकी यौगिकों के वितरण के स्थानिक वितरण elucidated है का उपयोग ^{करना,} जैसे 9-11 डीएनए और गतिशील और गैर चलता - फिरता कोशिकाओं के वितरण एक जीवाणु समुदाय ^4,6,9 (चित्रा 4c) के भीतर एक ही प्रजाति है. हम कल्पना है कि प्रवाह सेल प्रणाली खमीर biofilms के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह खमीर biofilm विकास में शामिल जीन की पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, fungicides जैसे पर्यावरणीय कारकों के जवाब में spatio खमीर biofilm के अस्थायी वितरण किया जा सकता है. हालांकि खमीर गतिशील और गैर चलता - फिरता कोशिकाओं में अंतर करने के लिए नहीं जाना जाता है, biofilm विविधीकरण के अन्य पहलुओं में रूपात्मक बदलाव और खमीर से pseudohyphal कोशिकाओं के लिए अगुणित से द्विगुणित कोशिकाओं को बदलाव के रूप में इस तरह के अध्ययन हो सकता है.

हम एक प्रणाली है कि कई माइक्रोबियल प्रजातियों के साथ अनुपालन और कई धुंधला तकनीक के साथ काम करेंगे पता चला है. अलग धुंधला जांच और GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, की एक किस्म, विकासशील biofilm में विशिष्ट आला जांच सक्षम और antimicrobial एजेंटों या अन्य पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का विश्लेषण करने में एक कुशल उपकरण है. जानकारी प्राप्त किया जा सकता है कि बहुत विस्तृत है (चित्रा 4) और biofilm में ^{सुविधाओं} को 12,13 COMSTAT के रूप में कंप्यूटर प्रोग्राम के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है.

कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह है कि यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया है. यह भी एक सीमा है कि कोशिकाओं को एक गैर फ्लोरोसेंट, पारदर्शी सतह पर विकसित करने में सक्षम होने की जरूरत है. प्रणाली उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक अनुभवी शोधकर्ता के रूप में उपयुक्त नहीं है, के बाद से biofilm गठन एक confocal खुर्दबीन, गहराई ^है कि कुछ सौ 14 माइक्रोमीटर तक सीमित है जांच किया जा सकता है का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है और आगे तकनीकी डिजाइन में निहित सीमाएँ हैं ज्यादातर प्रयोग, के बारे में 15 चैनलों के प्रति जो बारी में कई दिनों लेने के लिए तैयार कर सकते हैं पर संभाल कर सकते हैं. हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं या म्यूटेंट कि biofilm के अध्ययन के लिए प्रासंगिक माना जाता है शुरू क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के रूप में अन्य विधियों के साथ जांच से पहले सबसे दिलचस्प उम्मीदवारों प्रवाह सेल प्रणाली को हस्तांतरित कर रहे हैं बड़े पैमाने पर किया जा सकता है. कांच कवर शीट बहुत पतली है और आसानी से तोड़, और देखभाल जब सिस्टम हैंडलिंग लिया जाना चाहिए. टयूबिंग, इसके अलावा एक प्रयोग के चलाने के दौरान दैनिक जांच करना चाहिए, के रूप में काफी बस नदी के ऊपर प्रवाह कोशिकाओं के इनलेट ट्यूब में "वापस विकास" हो सकता है. इस तरह संदूषण सिलिकॉन ट्यूब के प्रवाह कोशिकाओं के इनलेट की ओर से कई सेंटीमीटर हटाने के द्वारा हल किया जा सकता है, बाँझ तकनीक का उपयोग.

चित्रा 4 4) दिन पुराने PAO1 - GFP Colistin और Propidium आयोडाइड के साथ 24 के लिए मृत (धुंधला लाल दाग) ख) एक तीन दिन के 3 डी प्रस्तुति पुराने पी. के लिए इलाज biofilm. PAO1 aeruginosa (पी. aeruginosa जंगली प्रकार) - GFP biofilm ⁶ ग) 3 डी एक PAO1 की तस्वीर प्रस्तुति - CFP Pila उत्परिवर्ती (नीला) के साथ एक PAO1 जंगली प्रकार YFP (पीला) घ) 5 दिन पुराने PAO1 - GFP biofilm एक 3 डी के रूप में प्रस्तुत चित्र) ई 26 घंटे एस. cerevisiae biofilm (CEN.PK पृष्ठभूमि में PTR3 उत्परिवर्ती) ¹⁵ Syto - 9 के साथ दाग .

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

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