Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서

실험을 시작하기 전에 필수 조건 :

• RNase가없는 물을 RNA가 RNases에 의해 저하되는 위험을 줄이기 위해 실험실에서 RNA의 취급에 사용됩니다. 이러한 목적으로, 물, 일반적으로 37 최소한 1 시간 동안 0.1 % V / V diethylpyrocarbonate (DEPC)로 처리됩니다 ° C 후 DEPC의 흔적을 inactivate하는 (적어도 15 분) autoclaved.
• Pipetman의 pipettes은 사용하기 전에 RNase의 오염 제거 솔루션 (RNase 해충 구제, 생물 산업 베이트 Haemek)으로 세척하고 있습니다.
• Eppendorf 튜브 및 도움말은 샘플 무결성을 유지하기 위해 DNase 및 RNase 무료 인증해야합니다.

1. tRNA ^ASP 준비

이 절차는 tRNA의 합성에 사용될 수 있습니다 체외 실행에서 전송에 대해 설명합니다. 이 절차는 이전에 다음 ID로 출판 ribozyme 메서드의 적응이다. 템플릿 T7 프로 모터와 자기 cleaving ribozyme 해머하고 필요한 tRNA의 보완적인 시퀀스로 구성된 설계되었습니다 이러한 목적을 위해 ^9. 제품이 템플릿 결과의 전사는 전체 길이 tRNA가와 취득 것을 방법으로 5`- 끝에 자체를 cleaving 5`- OH 대신 phosphorylated 5`- 끝. 전체 길이 tRNA는 우레아 페이지로 죽습 해머 ribozyme과 uncleaved 제품에서 정화 수 있습니다.

1. PCR 프라이머 및 템플릿 디자인 :
   
   시험 관내 전사의 T7 RNA 중합 효소의 - 중재를위한 효율적인 템플릿을 얻기 위해 세 요건은 충족해야합니다.
   1. T7 - 발기인 순서 (5`- TAATACGACTCACTATA - 3`) 템플릿에 연루되어야한다.
   2. 전송 효율을 향상시키기 위해, 베꼈는데 RNA의 처음 세 개의 세포핵은 구아 노신해야합니다.
   3. 특정 tRNA의 올바른 순서 보완이 필요합니다.
   아니 모든 tRNA 두 번째 조건을 충족 이후, 우리는 여기에 추가 자체 cleaving 해머 헤드 ribozyme를 들고 템플릿을 설명합니다. ⁹ 그림 1에 묘사된 전형 DNA 템플릿 순서는 호모 사피엔스 tRNA ^ASP (블랙)와 해머 ribozyme의 보완적인 시퀀스로 구성되어 있습니다 ( 자주색) tRNA의 아홉 5`- 기지 (조명 보라색)을 보완. 5 효율적인 전사 (조명 주황색)가 위치한 활성화 여섯 뉴클레오 티드 시퀀스를 포함하여 T7 -​​ 발기인 순서 (오렌지)를`엔드. 녹음 후, 해머 ribozyme은 ribozyme과 전체 길이 tRNA (그림 1B)를두고 사본을 자체를 클리브스. 후자는 ribozyme과 uncleaved 제품 요소 페이지에서 정화 수 있습니다. 앞으로 뇌관의 디자인, 이것이 뇌관 순서는 효소의 바인딩을 사용하는 모터의 순서`최소한 5 세포핵 5 연장되어야한다는 것을 고려되어야한다. 이러한 추가 세포핵이 템플릿 DNA의 3`- 끝에 누락 될 수 있습니다. 여기 우리는 전사가 개시 이후 타타 순서로 끝나는, T7 프로 모터 시퀀스를 포함하는 전달 프라이머를 사용합니다. 이 입문서는 보완 T7 프로 모터 시퀀스를 (모두 T7 시퀀스는 그림 1A에서 색 오렌지색됩니다) 포함된 다른 tRNA 템플릿에 대한 보편적으로 적용됩니다. 역방향 프라이머는 primers하고 효율적인 증폭 모두의 바인딩을 보장하기 위해 전체 전달 뇌관과 같은 녹는 온도가 있습니다.
2. PCR
   템플릿 DNA의 증폭을 위해, 우리는 50 μL의 최종 볼륨에서 표준 PCR 반응를 사용했습니다. 표 1 자세한 최종 농도 (반응 얼음 준비) 및 PCR을위한 프로그램. DNA를 템플릿에 전달 뇌관의 유일한 부분 바인딩의 초기 10주기 계정 중 사용하는 낮은 풀림 온도. 어닐링 온도를 구속하는 것은 unspecific 줄이기 위해 추가로 25 증폭주기 위해 증가했다.
   템플릿 증폭의 성공은 아가로 오스 겔은 1X GelRed 솔루션 (그림 2)와 prestained 1.3 %에서 테스트되었습니다.
3. 전사
   1. T7의 premix을 준비할 수 5 배 농축 (200 MM 트리스 - HCL, pH를 8.1, 30 MM MgCl _2, 1 ㎜의 Spermidine, 5 MM DTT, 2 μg / ML BSA와 0.01 % 트리톤 X - 100)와 적어도 하나 사용되었다 주 5 동결 해동 사이클.
   2. 전사 혼합물은 실온에서 준비되어야한다.
   3. 전사 반응을 80 μL T7의 premix, 80 μL PCR 제품, 80 μL NTP 믹스를 (25 ㎜)를 사용 준비와 MilliQ의 물로 385 μL로 조정되었습니다. 15 μL (1.34 MG / ML) T7 RNA 효소는 (0.05 μg / μL 최종 농도) 반응을 시작하는 추가됩니다.
   4. 반응은 37 ° C.는 4 H 위해 실시되었다 나트륨의 흰색 침전물이 성공적으로 전송을 나타냅니다.
4. 정화
   1. 나트륨은 10,000 RPM에서 1 분 다운 소용되었다.
   2. Supernatants 한 볼륨 formamid가 염료를로드하고 사용하여 12 % 요소 페이지에서 정화와 함께 제공되었습니다2 시간 20 W. 젤 분리 및 사란 포장에 놓으십시오.
   3. 20 분 동안 0.1 M NaCl과 보충 3XGelRed 솔루션 젤 얼룩. UV 여기시, 라벨 나중에 절단을위한 영구 마커로 사란 랩에있는 tRNA 밴드. 또는 예상 수확량은 50 μg 밴드 위에있다면 UV - 미행하여 볼 수 있습니다. UV - 미행 들어, 형광 박막 크로마 토그래피 판에 젤 장소 이상에서 UV - 손으로 램프와 조명. 나중에 절단을위한 젤이 아닌 형광 그림자 (그림 3)과 같이 나타납니다 라벨 밴드.
   4. tRNA 밴드는 메스와 excised 및 1.5 ML Eppendorf 컵에 투입되었다.
   5. 0.5M NH ₄ OAc 샘플 450 μL를 추가 후 -80에 얼어 ° 2 시간 동안 C는 그 후 20 incubated ° C를 밤 동안 Eppendorf Thermoshaker에 550 RPM과 함께 떨리고. 6. 5 단계에서 뜨는 NH ₄ OAc 솔루션은 페이지의 파편을 제거하는 8,500 rpm으로 90 초 방직, Nanosep 튜브 (0.45 μm의)와 필터링됩니다.
   6. eluted tRNAs의 강수량은 2.5 -80의 볼륨 ° -20에서 C 순수 에탄올 (PA), 저장 ° 4 C 야간 및 2.5 H의 원심 분리 ° C와 15,500 RPM.을 추가하여 수행되었다
   7. 제거 후 뜨는 알약은 Speed​​Vac에서 건조되었으며 MilliQ 물에 resuspended.
   8. 농도는 Nanodrop - ND1000을 사용하여 결정됩니다. 한 400 μL 전사의 수확량은 약 80-100 μg했다.

문제 해결 :

• 없음 PCR 제품 없습니다. →이 primers와 호환 템플릿의 순서이며, 모든 구성 요소는 반응 혼합물 안에서입니까?
• 없음 전사 제품 없습니다. → PCR 실패되었을 수 있습니다. 올바른 T7 -​​ 발기인 순서. 너무 추운 솔루션 반응을 준비하는 동안. 너무 오래 T7의 Premix.
• 겔에서 제품했지만, eluted 제품입니다. 순수하지 않은, 충분한 강수량을위한 → 에탄올 춥지 않아 아니라 올바른 볼륨.

2. 표현과 재조합 E.의 정화 E. histolytica에 Dnmt2 (Ehmeth) 단백질 대장균 BL21

이 프로토콜은 인간의 ¹⁰ Drosophila에서 Dnmt2 단백질의 준비에도 적합합니다. ¹¹

1. E. histolytica Ehmeth 유전자는 PCR에 의해 증폭 pGEX 4NT1 (GE 생명 과학)의 복제 및 시퀀싱과 함께 확인했습니다
2. 재조합 플라스미드가 E.으로 변화되었다 재조합 단백질의 표현에 대한 대장균 (BL21).
3. 변형 박테리아는 Luria - Bertani (LB) 한천 암피실린 (100 μg / ML) 매체에 선정되었습니다. 5 대 4로 식민지가 데리러와 LB 미디어의 5 ML에 주사를 맞는 선택적 마커 (100 μg / ML 암피실린)과 37 궤도 통에 하루 incubated되었습니다 ° C.
4. 하룻밤 재배 문화를 100 μg / ML 암피실린와 2X 효모 추출 Tryptone (2XYT) 중간 500 ML에 주사하고, 37 궤도 통에 incubated되었습니다 ° C의 문화의 OD _600까지 0.8에 도달했습니다.
5. Dnmt2 재조합 단백질의 표현은 문화에 0.5 mm의 최종 농도에 이소 프로필 - 베타 - D - thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가하여 유도되었다. 문화 추가 24 ° C. 16 시간 동안 궤도 통에 incubated되었습니다 부화의 시간과 온도는 포함 기관의 형성을 방지하도록 최적화되었습니다.
6. 문화 4 centrifuged되었습니다 ° C, 15 분 동안 200 ML Nalgene 튜브에 6000 RPM. 뜨는은 폐기되었으며 펠렛은 최소한 1 시간 동안 -70 ° C에서 냉동되었습니다. 이 동결 단계는 박테리아의 용해을 향상시킵니다.
7. 펠렛은 용해 완충액 (100 MM KCl, 1mM DTT, 1mM PMSF, 100 μg / ML 라이 소 자임하고 Leupeptine 100 인산염 버퍼 호수 (PBS)에 μg / ML) 30 ML에 수확했다. 이 시점에서, 그것은 재조합 단백질의 불활 성화를 방지하기 위해 얼음에 lysate를 유지하기 위해 중요했다. lysate없이 설정에서 얼음 물을 욕조에 sonicated되었습니다. 4 MSE (런던, 영국) sonifier (전원 높이 진폭 5 30 초 펄스 5 분 30 초 휴식). Ehmeth에 첨부할 수 있습니다 박테리아 DNA는 얼음에 30 분 Benzonase Nuclease (Novagen) 치료 (5 U / sonicated lysate의 ML)로 제거되었습니다. 용해는 30 분 BugBuster 단백질 추출 시약 (Novagen) 300 μL를 추가하여 완성 4 ° C 궤도 쉐이크 (100 RPM)에 부드러운 선동과 함께.
8. 재조합 GST - Ehmeth 단백질은 제조 방법 (시그마)에 따라 글루타티온 - 아가로 오스 수지에 대한 기본 조건 정화되었다. lysate 25 ML 들어, 슬러리 수지 비즈 500 μL는 24 추가 및 incubated되었습니다 ° C 1 시간.
9. 구슬은 추위 PBS로 용해 완충액 (구슬의 부피 당 용해 완충액 10 권), 6 시간을 두 번 씻어했다. 이러한 광범위한 세척 단계는 elutio 전에 Benzonase의 남아 있다고 확보하지N 단계.
10. 재조합 Ehmeth 단백질 4 12 시간 글루타티온의 용출 버퍼 5 ML (트리스 HCL 50 MM의 산도 8.0, 글루타티온 (시그마) 10 MM) · 부드러운 회전 C와 구슬을 잠복기로 글루타티온 아가로 오스 비즈에서 eluted했다. 구슬은 원심 분리 (2,000 RPM, 5 분)에 의해 제거되었고 뜨는가 수집되었다.
11. 뜨는의 용출 버퍼가 저장 버퍼 (KCl 200 MM, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 MM 0.1 MM의 DTT, 글리세롤 PBS의 60 %)으로 대체되었습니다. 이를 위해 뜨는 5 ML은 Millipore Microcon YM - 30 원심 필터 장치를 4에 20 분 동안 8,000 rpm으로 (30 KDA는 열 잘라)와 centrifuged ° C. 위에 적재가되었던 것 농축 단백질이 저장 버퍼 (5 ML)에 희석하여 필터 장치에 다시로드되었습니다. 동일한 절차를 저장 버퍼로 용출 버퍼의 완전한 대체를 확보하기 위해 최소한 3 번 반복해야합니다. 마지막으로 집중 단백질이 저장 버퍼의 약 300 μL의 희석해야합니다.
12. 재조합 단백질의 농도는 브래드 포드 단백질 분석에 의해 측정되었다. 재조합 효소 준비는 -20 ° C.에 저장된 효소의 최종 농도는 methylation 분석에 적합한 농도로 3 μg / μL 이상이어야한다.
13. 단백질 준비는 SDS - PAGE에 의해 확인되었다.

공지 사항 : 활성 효소의 준비를 확보하기 위해이 모든 정화 단계는 얼음에서 수행되어야하며 DTT는 신선한 및 저장 버퍼에 추가되어 있어야합니다. 이것은 6 개월 동안 적극적인 효소를 처리됩니다.

3. 체외 TRNA의 Methylation 분석에서

솔루션 및 준비되어야 시약 :

1. 트리스 (히드록시 메틸) aminomethane 1 M 솔루션입니다. 농축 염산 (HCL)과 함께 8.0 솔루션의 산도를 조정합니다.
2. 배 Methylation 버퍼 (MB) : 100 MM 트리스 산도 8.0, 100mM NH ₄ OAc, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM MgCl _2. 메가바이트는 dithiothreitol (DTT)하지 않고 사전에 준비하고 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 증류수의 101.67 ML 5 μL AdoMet (뉴 잉글랜드 Biolabs, 32 MM 농도)를 혼합하여 레이블이 지정되지 않은 S - adenosylmethionine (AdoMet) 주식 (최종 농도 1.5 MM)를 준비합니다.
4. 5% Trichloroacetic 산성 솔루션 (TCA)
5. 100 % 에탄올
6. 샘플 병을 당 섬광 액체 3 ML.

분석 :

1. pipeting 방식은 methylation 분석을 40 μL 최종 볼륨 (표 2) 준비가되어 있습니다.
2. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 tRNA 5 μm의의 최종 농도 (1μg tRNA 40 pmol 동일합니다)에 DEPC 처리된 물로 희석되었다
3. DTT 4 μL는 5XMB 솔루션 8 μL에 (주식 솔루션의 농도)에 추가되었습니다.
4. tRNA 솔루션 2 분 3 단계에서 준비한 솔루션 ° C가 그것에 즉시 추가되었습니다 85에서 incubated했다. 혼합물이 올바르게 tRNA 이동 준비를하도록 15 분간 실온에서 진정 허용되었습니다.
5. AdoMet 믹스 (최종 농도 200 μm의)는 레이블이 지정되지 않은 AdoMet 150 μm의으로 표시 AdoMet 50 μm의 (250 μCi, 10.0 CI / mmol, PerkinElmer)를 혼합하여 준비되었습니다. 10 라벨 반응에 적합한 AdoMet 믹스 위해, 우리는 레이블이 지정되지 않은 AdoMet의 5.2 μL (희석 용액에서), 증류수의 μL 29 분류 AdoMet의 μL와 5.8 혼합.
6. 위의 준비 AdoMet 믹스 4 μL는 tRNA 솔루션에 추가되고 37 ° C. 2 분 incubated되었다
7. tRNA methyltransferase, Ehmeth (10-10 μm의 최종 농도)는 tRNA 기판 및 레이블 - 레이블이 지정되지 않은 AdoMet의 cofactor를 포함하는 솔루션에 추가되었습니다. 혼합물은 37 ° C. 3 시간 동안 incubated되었습니다 튜브가 부드럽게 그들을 틀지하여 부화의 시간 동안 정기적으로 혼합했다. 효소 반응의 운동 곡선은 3 시간 동안 반응 혼합물에서 매 20 분 샘플 (8 μL)를 복용하여 지어졌습니다.
8. (AdoMet 샘플,하지 않아야 표 2 열 E를 제외한 각각의 샘플은 즉시 왓먼 필터 (0.5 cm 직경)의 중앙에 발견되었으며 필터는 5 % TCA 용액에 담가 10 분 동안 얼음에 적극적으로 ) 세탁. 5% TCA 솔루션으로 세척 단계는 두 번 더 반복되었습니다
9. 필터는 10 분 얼음에 100 % 에탄올로 씻은했다.
10. 필터는 20 분 최소 공기 건조되었다.
11. 각 건조 필터는 이전에 다음 ID로 섬광 액체 3 ML (CytoScint)로 가득 차 있었다 튜브 (사양)에 배치되었다
12. tRNA에 통합 방사능은 신틸레이션 계수기 (카운터 베타 트라이 수화물 2100TR)을 사용했습니다.

4. 문제 해결

• 열의 높은 값 또는 B (표 3), 제어 샘플 값 열 C 또는 D의 methylation 반응 (표 3) → 필터가 제대로 씻어되지 않은 기대 비슷한되었습니다.
• 열 C 또는 D (표 3)에서 낮은 값을, methylation 실험은 열의 제어 반응과 비슷한 값을 가진 또는 B (표 3) → 효소가 더 Adomet의 설립이 없었다는 의미가 제대로 준비되지 않았습니다. 또 다른 옵션은 tRNA가 저하되었으며 효소에 적합한 기판 아니었 즉, 이것은 요소의 아크릴 아미드 젤에있는 tRNA 샘플을 실행 (1.2 참조)와 tRNA의 무결성을 검사 ethidium의 브로마이드와 젤 염색법으로 확인하실 수 있습니다 .
• 열 D의 낮은 값 (표 3) → Ehmeth의 활동 hDnmt2 효소 성능이 저장 버퍼에 DTT 농도를 증가 (10 ~ 1 사이의 MM을 다양) 또는 효소 농도를 증가함으로써 향상시킬 수 있습니다 다음 약한이기 때문에 효소의 품질을 일시적으로 완화시키다.
• 열 E의 낮은 값 (표 3) →이 열은이 열의 값이 낮은 경우는 AdoMet는 더 이상 운영되지 않습니다과를 잃어있다는 것을 의미합니다 표시된 AdoMet 값 (100 %라고도 함)의 총 방사능을 나타냅니다 방사능.

5. 대표 결과

표 1 : PCR 및 PCR 프로그램 피펫 방식.

표 2. 구성표를 pipeting의 예 스키마의 각 열은 하나의 샘플을 나타냅니다.

* Ehmeth과 hDnmt2 모두 62 KDA의 예상 단백질의 크기와 GST 태그에 융합되었다.
Ehmeth만을 포함 - 음성 제어합니다.
단 tRNA를 포함 B - 음성 제어합니다.
인간 Dnmt2와 C - 양성 제어할 수 있습니다. 이 효소는 Ehmeth보다 10 시간 이상 활동이
효소, 기판과 cofactor을 포함 D - 표준 반응
필터에 AdoMet의 E - 총 값입니다. 이 값은 메틸 그룹 통합의 비율의 계산에 사용됩니다.

표 3 :. 신틸레이션 계수기에서 읽을 가치 예제 스키마의 각 항목은 표 1에서 한 샘플을 나타냅니다.

그림 1 : (A) T7의 전사 템플릿 및 체외의 해독에 대한 primers. 모든 시퀀스 5 방향 '3'에 기록됩니다. Colorcode : 텍스트를 참조하십시오. 녹음하는 동안 제품 형성의 (B) 제도. RNA의 성적표는 T7 RNA 효소에 의해 합성됩니다. 각각의 2D - 구조와 ribozyme에 해머 ribozyme과 tRNA 접어들은 5' - 엔드 ⁽⁹ 적응)에 수산기 그룹을 떠나는 tRNA의 자체를 클리브스.

그림 2. 아가로 오스 겔은 두 개의 서로 다른 템플릿에 1X GelRed PCR 반응과 prestained 1.3 %에서 PCR 반응 제어 100 basepairs 플러스 사다리 옆에 표시됩니다. 제어는 "템플릿에만 '차선과 반대 뇌관이 생략되었다하는 반응을 포함합니다.

그림 3 :. UV - 미행이 전사 혼합물의 페이지 분리가 표시됩니다. 그들은 형광 TLC 판에 도달에서 자외선을 막기 때문에 전구체 성적의 밴드 (절단하기 전에), 전체 길이 tRNA와 해머 ribozyme은 그림자처럼 표시됩니다. E.에서 총 tRNA 대장균은 크기의 표지로 사용됩니다.

이 프레 젠 테이션에서, 우리는 E.의 tRNA methyltransferase 활동의 측정에 대한 활성 구성 요소를 준비하는 방법을 그림 histolytica Ehmeth 효소. 이 절차를 시작 지점으로 사용할 수 있으며, 쉽게 다른 tRNA의 methyltransferases의 측정에 대한 적응. 효소 활동의 최적의 조치를 확보하기 위해 tRNA 기판과 tRNA methyltransferase 단백질의 품질과 무결성을 보존 절차를 수행하는 것이 중요합니다.