JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

IonFlux: Otomatik Plaka Okuyucu Basitlik Patch Kelepçe Sistemi - REKLAM

Article
    Downloads
    Comments Metrics
     

    Sign in to register to receive emails with product information.

    Abstract

    İyon kanalları, merkezi sinir sistemi ve sinir ve kas fizyolojisi düzenlenmesinde kritik bir rol oynamaktadır. Sonuç olarak, şeker hastalığı ve epilepsi gibi pek çok hastalık koşullarında karıştığı ve yeni ilaçlar için önde gelen hedefleri olmuştur. Yama kelepçe yöntemi, in vitro iyon kanal aktivitesini değerlendirmek için altın standarttır. Manuel moda uygulandığında, yama kelepçe tahlil anlamlı bir ilaç keşfi ve kalkınma çabaları için gerekli eşik değerinin altında günde 10 civarında veri noktaları, sınırlıdır. IonFlux platformu, hem voltaj ve ligand kapılı iyon kanalları da dahil çok geniş bir uygulama yelpazesi, barındırmak için iki ölçeklenebilir yapılandırmaları gelir, rahat ve yüksek kapasiteli plaka biçimi yama kelepçe yöntemi otomatikleştirmek için tescilli Peki Plaka mikroakışkan teknolojisi kullanır. IonFlux HT ilaç keşfi ve gelişimi yüksek kapasiteli tarama için uygundur. Bu sürüm Günde ortalama 10.000 veri noktalarına kadar üretme yeteneğine sahiptir. Günde ortalama 40.000 veri noktaları için ek throughput için, dört IonFlux HT sistemleri tek bir sıvı taşıma robotun etrafında dizilmiş olabilir. Veri noktası başına düşük maliyet ve en az bileşik kullanım uyuşturucu taraması, ilaç geliştirme, güvenlik toksikoloji, ve iyon kanalı araştırma IonFlux HT ideal hale getirir. IonFlux 16 hücre hattı geliştirme, mutant tarama, test geliştirme gibi orta hacimli uygulamalar için maliyet-etkin bir çözümdür. Ilk defa, kullanıcılar manuel bir yama kelepçe donatmak için karşılaştırılabilir bir maliyetle gerçek otomatik yama kelepçe teknolojisi erişim var.

    Protocol

    1. IonFlux Sistemi Genel Bakış

    1. IonFlux Sistemi, bir masa üstü aracı, SBS standart plaka biçimi mikroakışkan özel bir cihaz, ve tam bir satın alma ve analiz yazılımı paketi oluşur.
    2. Diğer otomatik yama kelepçe araçların aksine, IonFlux okuyucu, çok az yer kaplayan bir plaka okuyucu yakından benzer tutar. Benchtop kolayca uyar, ve yaygın olarak kullanılan laboratuvar otomasyon robotları ile kullanılabilir entegrasyona sahiptir IonFlux mevcut yüksek kapasiteli tarama iş akışları yanı sıra araştırma laboratuarları sorunsuz bir şekilde uyum sağlar.
    3. IonFlux topluluk kayıt, 20 hücre bir nüfus her kayıt bölgesi yamalı ve akımları tek bir veri noktası üretmek için ortalama kullanır. Bu yaklaşım, yüksek bir başarı oranı üretir ve hücre değişkenlik etkisi en aza indirir.
    4. Her 384-plaka 256 benzersiz bileşikler süreci ve 512 veri noktaları üretebilir. IonFlux 16 süreçleri ile kullanılan 96-plaka 64 bileşikler ve 128 veri noktaları üretir.
    5. Yüksek kapasiteli elektrofizyoloji ekranları çalıştırmak için yeteneğine sahip, geniş bir iyon kanalı deneyler kapı açılır. Ortak uygulamaları GABA ve nikotinik reseptörleri, sodyum ve potasyum kanallarının voltaj kapılı kanallar, ve hERG potasyum kanal odaklanan güvenlik toksikoloji gibi ligand kapılı kanallar ile ilgili deneyler. Mutant ve hücre hattı ekranları da yapılabilir. Ayrıca, IonFlux iyon kanalları fonksiyonel ifade analizi sağlar.

    2. Veri Toplama ve Analizi

    1. IonFlux Sistemi veri toplama ve analiz için gelişmiş bir yazılım paketi ile geliyor. Kur, Süre ve Veri Analizi: Yazılım yüklendikten sonra, kullanıcı, üç ana ekran göreceksiniz.
    2. Kur modunda bir deney tanımlamak için gerekli tüm kontrolleri içerir. Bu modda, deney başlatılır ve tam veya yarım tabak belirlenmiş. Kullanılan bileşiklerin tablo aynı zamanda set-up modunda ithal edilmektedir.
    3. Başbakan, tuzak, Break ve Veri Toplama: Deneysel Sıra sekmesinde, parametreler deney dört aşamaları için ayarlanır. Burada, gerilim protokoller tanımlanmıştır.
    4. Süre modu toplanmış olan verileri gösterir. Gerçek zamanlı Sweep Pencere, her kanal için her gerilim darbe sırasında oluşturulan akımlar görüntüler. Deneysel ilerleme da bildirilmiştir.
    5. Veri Analizi modu tamamlanan deneyler hızlı inceleme ve analiz sağlar. Araçları, süpürme ve izleme verileri yanı sıra bileşik giriş gibi belirli olayları günlüğe kaydetmek için görüntülenmesi için verilmektedir. Hit Haritası modülü ekranda en çok gelecek vaat eden bileşikler belirlemenize yardımcı olur. Tüm verileri kolayca Excel ve diğer veritabanı uygulamaları için. Csv formatında ihraç edilebilir.

    3. IonFlux Uygulamaları - GABAA Modülatörler

    1. IonFlux Sistem üzerinde çeşitli deneyler ve hedef ekranlar yapılabilir. Burada, Millipore HEK293 hücreleri ifade insan GABA-A reseptör modülatörleri, tahlil için bir örnek gösterilmiştir. Bu ligand kapılı klorür kanal böylece, epilepsi, anksiyete, ve uykusuzluk önemli bir ilaç hedefi oluşturan, santral sinir sistemi inhibisyonu ile ilgilenmektedir.
    2. Tarama testleri gerçekleştirmek için, hücre topluluklarından reseptör allosterik yerinde bağlama modülatör maddelerin konsantrasyonları artan varlığı, yerli ligand GABA EC20 konsantrasyonlarına maruz bırakıldı.
    3. Bu araziler, 3 nM ve 0.5 mcM EC50 değerleri elde edildiği yani triazolam ve diazepam benzodiazepin sınıfında iki pozitif allosterik modülatörleri, doz-yanıt eğrileri göstermektedir.
    4. Belirgin GABA afinite modülatör bağımlı vardiya sonra kümülatif Bu durumda, 3 mcM diazepam, modülatör sabit bir konsantrasyon varlığı farklı GABA konsantrasyonları uygulayarak tespit edildi.
    5. Bu tür deney IonFlux araçların mevcut akış yoluyla akışkan tasarım etkindir. GABA için EC50 modülatör varlığında artış afinitesi nedeniyle düşük konsantrasyonlarda yaklaşık 1 mcM kaymıştır.

    4. IonFlux Uygulamaları - Nöronal hNav1.8 Sodyum Kanal Engelleyiciler

    1. IonFlux Enstrüman de burada, nöronal hNav1.8 sodyum kanal, ağrı algısında yer alan bir gerilim-kapılı kanal blokerleri için tipik gösterilen örnek de dahil olmak üzere diğer farmakolojik deneyler, kolaylaştırır. Bu testte, HEK293 hücrelerinde ifade edilen Na + kanal, her saniye uygulanır, 0 mV ile -120 mV gerilim kelepçe adımlarla aktive edildi.
    2. Bu protokol, bu nedenle kanal depolarizat arasında dinlenmiş devlet yeniden girdiğinden beri, kanal tonik blok hakkında bilgi sağlariyonları. Kümülatif bloker doz-yanıt eğrileri sırasıyla, 320 mcM ve 34 mcM IC50 değerleri sağlayan, lokal anestezikler lidokain ve tetrakain gösterilmiştir.
    3. Ikinci bir grafikte, hNaV1.8 için lidokain afinite hNaV1.7 için, başka bir voltaj-kapılı Na + kanal ağrı hissi yer karşılaştırılır . HNaV 1.7 IC50 hNaV1.8 ile karşılaştırıldığında on kat daha düşük afinite açıklamadan bu kanal lidokain bağlar 3 mM olarak bulunmuştur.

    5. IonFlux Uygulamaları - hERG Tarama

    1. IonFlux enstrüman hERG tarama gibi güvenlik farmakoloji uygulamaları için de kullanılabilir. HERG potasyum kanal piyasada çeşitli ilaçlar ile ilişkili istenmeyen kardiyak olaylar, onların çekilme yol suçlanmıştır; ve şimdi tüm yeni uyuşturucu bileşikleri bu kanalın karşı ekranlı olması gereklidir.
    2. Engelleyicisi doz-yanıt eğrileri olmak üzere üç yaygın olarak kullanılan referans bileşikleri, terfenadin, sisaprid ve kinidin CHO hücrelerinde ifade karakteristik voltaj bağımlılığı hERG kanalları yapıldı.
    3. Grafikler hERG kanallarını aktive edildiğinde hERG kuyruk akımlar ortaya çıkarmak için kullanılan hızlı inaktivasyon oranı nedeniyle gerekli bir iki darbe protokolü, elde edilen tipik geçerli profil göstermektedir. Grafikler aktivasyon gerilim-bağımlılık ve IonFlux enstrüman kaydedilen hERG akım düzeltme özellikleri göstermektedir.
    4. Bu kayıtlar yakından literatürde temsil ettiği kabul edilen kanal davranışını taklit eder. Bloker doz-yanıt eğrileri 60 nM üç referans bileşikleri, 160 nM, ve 1 mM için IC50 değerleri ortaya koymaktadır.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter