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IonFlux: Système automatisé de Patch Clamp avec simplicité lecteur de plaque - PUBLICITÉ

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    Abstract

    Les canaux ioniques jouent un rôle crucial dans la régulation du système nerveux central et la physiologie des nerfs et des muscles. En conséquence, ils ont été impliqués dans de nombreuses pathologies comme le diabète et l'épilepsie, et sont des cibles de premier plan pour de nouveaux médicaments. La méthode patch-clamp est l'étalon or pour évaluer l'activité des canaux ioniques in vitro. Lorsque mis en œuvre dans un mode manuel, le dosage de patch-clamp est limitée à environ 10 points de données par jour, ce qui est bien en dessous du seuil nécessaire pour la découverte de médicaments utiles et les efforts de développement. La plate-forme IonFlux utilise la technologie exclusive Plate Eh bien microfluidiques pour automatiser la méthode patch-clamp dans un format pratique et plaque de débit élevé ainsi que se décline en deux configurations évolutives pour accueillir une large gamme d'applications, y compris deux de tension et des canaux ioniques ligand-dépendants. Le HT IonFlux est adapté pour le criblage haut débit dans la découverte et le développement. Cette version est capable de produire jusqu'à 10.000 points de données par jour. Pour un débit supplémentaire, jusqu'à quatre systèmes IonFlux HT peuvent être disposés autour d'un robot de manipulation de liquides simples pour un maximum de 40 000 points de données par jour. Le faible coût par point de données et l'utilisation de composés minimale font l'idéal IonFlux HT pour le dépistage de drogue, le développement de médicaments, la toxicologie de la sécurité, et la recherche des canaux ioniques. Le IonFlux 16 est une solution rentable pour les applications de débit modérées telles que le développement de lignées cellulaires, de dépistage mutant, et le développement du dosage. Pour la première fois, les utilisateurs ont accès à une véritable technologie de patch clamp automatisé à un coût comparable à une plate-forme de patch-clamp manuelle.

    Protocol

    1. Présentation du système IonFlux

    1. Le système IonFlux est composé d'un instrument de paillasse, un dispositif microfluidique exclusif dans un format standard SBS plaque de bien, et une acquisition complète et logiciel d'analyse.
    2. Contrairement à d'autres instruments automatisés de patch-clamp, le lecteur IonFlux maintient un très faible encombrement, qui ressemble étroitement un lecteur de plaques. Il se glisse facilement sur la paillasse, et a l'intégration disponibles avec couramment utilisés robots d'automatisation de laboratoire, permettant à la IonFlux pour s'intégrer parfaitement dans les workflows existants haute criblage à haut débit ainsi que des laboratoires de recherche.
    3. Le IonFlux utilise l'enregistrement d'ensemble, ce qui signifie que la population de 20 cellules sont patchés dans chaque zone d'enregistrement, et leurs courants sont en moyenne pour produire un seul point de données. Cette approche donne un taux de réussite élevé et minimise l'effet de la variabilité cellulaire.
    4. Chaque plaque de 384 puits peut traiter 256 composés uniques et produire 512 points de données. La plaque de 96 puits utilisés avec les 16 IonFlux processus 64 composés et produit 128 points de données.
    5. Ayant la possibilité d'exécuter des écrans haute électrophysiologie débit ouvre la porte à un large éventail d'expériences de canaux ioniques. Les applications courantes incluent des expériences avec un ligand des canaux fermée tels que les récepteurs GABA et nicotinique, la tension canaux fermée comme les canaux sodiques et potassiques, et de la toxicologie de la sécurité en se concentrant sur le canal potassique hERG. Écrans lignée mutante et cellulaire peut également être effectuée. En outre, les IonFlux permet l'analyse de l'expression fonctionnelle des canaux ioniques.

    2. Acquisition de données et d'analyse

    1. Le système est livré avec une IonFlux logiciel avancé d'acquisition de données et d'analyse. Une fois le logiciel chargé, l'utilisateur verra trois écrans principaux: installation, d'exécution et d'analyse des données.
    2. Le mode d'installation contient tous les contrôles nécessaires pour définir une expérience. Dans ce mode, les expériences sont initialisés et plaque tout ou la moitié est désignée. La table des composés utilisés sont également importées dans le mode de configuration.
    3. Dans l'onglet Séquence expérimentale, les paramètres sont définis pour les quatre phases de l'expérience: le premier, Piège, Pause, et acquisition de données. Ici, les protocoles de tension sont définis.
    4. Le mode d'exécution montre les données telles qu'elles sont recueillies. La fenêtre de balayage en temps réel affiche les courants générés lors de chaque impulsion de tension pour chaque canal. Progrès expérimentaux sont également signalés.
    5. Le mode d'analyse des données permet examen rapide et l'analyse des expériences terminées. Des outils sont fournis pour la visualisation des données de balayage et de trace, ainsi que pour la journalisation des événements spécifiques tels que l'introduction composé. Un module de carte Hit permet d'identifier les composés les plus prometteurs dans l'écran. Toutes les données peuvent être facilement exportées au format. Csv pour les applications de bases de données Excel et d'autres.

    3. Applications IonFlux - Modulateurs GABAA

    1. Une grande variété d'expériences et d'écrans cible peut être effectuée sur le système IonFlux. Ici, un exemple est montré pour le dosage pour des modulateurs de l'humain récepteur GABA-A, exprimée dans les cellules HEK293 de Millipore. Ce canal chlorure ligand-dépendants est impliqué dans l'inhibition du système nerveux central, constituant ainsi une cible thérapeutique importante dans l'épilepsie, l'anxiété et l'insomnie.
    2. Pour effectuer des tests de dépistage, des ensembles de cellules ont été exposées à des concentrations de CE20 du ligand natif GABA, en présence de concentrations de substances ascendante modulateur qui lient sur le site allostérique sur le récepteur.
    3. Les graphiques montrent courbes dose-réponse pour deux modulateurs allostériques positifs dans la classe des benzodiazépines, à savoir le triazolam et le diazépam, pour lequel CE50 de 3 nM et 0,5 uM ont été obtenus.
    4. Le passage de modulateur-dépendante de l'affinité apparente de GABA a ensuite été déterminé par l'application de différentes concentrations cumulées de GABA dans la présence d'une concentration fixe du modulateur, dans ce cas, le diazépam 3 uM.
    5. Ce type d'expérience est activée par la conception accréditives fluidiques disponibles dans les instruments IonFlux. La CE50 pour le GABA a été déplacé d'environ 1 uM à des concentrations plus faibles en raison de l'affinité de liaison accrue en présence du modulateur.

    4. Applications IonFlux - bloqueurs des canaux sodiques neuronaux hNav1.8

    1. L'instrument IonFlux facilite également d'autres expériences pharmacologiques, dont l'exemple montré ici typique pour les bloqueurs de canaux sodiques neuronaux hNav1.8, un canal voltage-dépendants impliqués dans la perception de la douleur. Dans cet essai, le canal Na +, exprimée dans les cellules HEK293 a été activée par étapes voltage de -120 mV à 0 mV, appliqué à chaque seconde.
    2. Ce protocole fournit donc des informations sur le bloc tonique de la chaîne, depuis le canal de ré-entre dans l'état reposé entre depolarizations. Cumulatif bloqueur courbes dose-réponse sont illustrées pour les locaux de lidocaïne et de tétracaïne anesthésiques, fournissant IC50 de 320 nM et 34 uM, respectivement.
    3. Dans un deuxième graphique, l'affinité pour la lidocaïne hNaV1.8 est comparée à celle des hNaV1.7, un autre voltage-dépendants canal Na + impliqués dans la sensation de douleur. La CI50 pour hNaV 1,7 a été trouvé à 3 mM, révélant une affinité dix fois plus faible lorsque ce canal se lie lidocaïne, par rapport à hNaV1.8.

    5. Applications IonFlux - Dépistage hERG

    1. L'instrument IonFlux peut également être utilisé pour des applications pharmacologie de sécurité telles que le dépistage hERG. Le canal potassique hERG a été impliquée dans les événements cardiaques indésirables associés aux médicaments divers sur le marché, conduisant à leur retrait, et il est maintenant nécessaire que tous les nouveaux composés médicamenteux être criblés contre ce canal.
    2. Bloqueur de courbes dose-réponse ont été effectuées pour la caractéristique de tension canaux hERG-dépendance exprimée dans les cellules CHO pour trois composés de référence couramment utilisé, à savoir la terfénadine, le cisapride et la quinidine.
    3. Les graphiques montrent le profil de courant typique obtenu lorsque les canaux hERG sont activés par un protocole en deux impulsions, ce qui est nécessaire en raison de son taux d'inactivation rapide, utilisé pour révéler courants de queue hERG. Les graphiques montrent l'activation voltage-dépendance et de rectification des propriétés du courant hERG enregistrées dans l'appareil IonFlux.
    4. Ces enregistrements reproduisent le comportement de canal près acceptée représentés dans la littérature. Le bloqueur de courbes dose-réponse révèle IC50 pour les trois composés de référence de 60 nM, 160 nM et 1 mM.

    Disclosures

    Aucun conflit d'intérêt déclaré.

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