Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

1. Lever decellularisatie

1. Oogst een rat lever met poortader canulatie het gebruik en de 18-gauge katheter. Laat de lagere en hogere vena cava open. Houd het orgel gehydrateerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 10-cm petrischaal.
2. Stel een perfusie systeem dat bestaat uit 8-liter reservoir, peristaltische pomp en een opvanginrichting.
3. Vul het perfusie-systeem met fosfaat gebufferde zoutoplossing en houd het draaien voor 10 minuten. Vul PBS in een 10-cm petrischaal en vermindering van het debiet van fosfaat gebufferde zoutoplossing tot 1 ml / min.
4. Voorzichtig de geoogste lever naar de fosfaat gebufferde zoutoplossing gevuld 10-cm petrischaal.
5. 'S nachts doorgaan met PBS perfusie.
6. Begin perfusie met 0,01% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
7. Perfuseren met PBS gedurende 1 uur.
8. Herhaal de stappen 1.6 en 1.7 nog drie keer het verhogen van de SDS perfusie tijd tot 10, 15 en 20 minuten op elk tijdstip.
9. Ga door perfusie met 0,01% (w / v) SDS gedurende 24 uur.
10. Ga door perfusie met 0,1% (w / v) SDS gedurende 24 uur.
11. Perfuseren met 0,2% (w / v) SDS gedurende 3 uur.
12. Perfuseren met 0,5% (w / v) SDS gedurende 3 uur.
13. Perfuseren met gedestilleerd water gedurende 15 minuten.
14. Perfuseren met 1% (w / v) Triton X-100 in gedestilleerd water gedurende 30 minuten aan een gebonden nucleïnezuren te verwijderen.
15. Te wassen van de gedecellulariseerde lever matrix (DLM), perfuseren met PBS gedurende 2 uur.
16. Optioneel: reseceren alle lobben, behalve de mediaan lob.
17. Bewaar de DLM in een schone en verzegeld petrischaal gedrenkt in PBS bij 4 ^° C tot het klaar voor gebruik (figuur 1).
18. Voor het steriliseren van de DLM: 1) Spoel de DLM met steriele PBS met 0,1% (v / v) perazijnzuur en 4% (v / v) ethanol en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ^° C. 2) Was met steriele PBS twee keer. 3) Was met steriele PBS met 2% penicilline-streptomycine, 10ug / ml gentamicine en 2,5 ug / ml amfotericine B. Bewaar de gedecellulariseerde lever in dezelfde oplossing bij 4 ^° C tot het klaar is om te gebruiken voor recellularization experimenten.

2. Recellularization van gedecellulariseerde lever Matrix

1. Stel een perfusie-systeem dat bestaat uit een perfusie kamer, peristaltische pomp en een opvanginrichting, onder steriele omstandigheden. Vul het perfusie-systeem met 200 ml kweekmedium, bijvoorbeeld, een hoge glucose DMEM (Sigma), 10% foetaal runderserum (Hyclone,), 100 U ^ml-1 penicilline en 100 ug ^ml-1 streptomycine (Invitrogen).
2. Plaats de gedecellulariseerde lever matrix in de perfusie kamer en sluit de DLM om de perfusie-systeem via de poortader canule, terwijl de pomp draait op 5 ml / min tot de vorming van eventuele luchtbellen te voorkomen.
3. Laat perfusie van het medium door middel van de DLM gedurende 30 minuten.
4. Isoleer de primaire hepatocyten van een volwassen rat met ten minste 90% levensvatbaarheid.
5. Stop de stroming in de perfusie-systeem en langzaam 50000000 hepatocyten (in 1-3 ml kweekmedium) te injecteren in perfusie-systeem via de opvanginrichting.
6. Start het debiet bij 10 ml / min en recirculeren het medium voor 10 minuten.
7. Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 tot een totaal van 200 miljoen cellen worden ingevoerd in het DLM (figuur 2) ^6.
8. Als alle cellen perfusie in de DLM, het verzamelen van de perfusaat in vier van 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 600 rpm gedurende 10 minuten. Gooi de supernatants en verzamel de pellets in een enkele buis. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid via trypan blauw uitsluiting voor de seeding efficiency te bepalen.

3. In Vitro Cultuur van de Recellularized lever Graft

1. Stel een perfusie-systeem dat bestaat uit een perfusie kamer, peristaltische pomp, oxygenator en een opvanginrichting, onder steriele omstandigheden (figuur 3). Vul het perfusie-systeem met 50 ml kweekmedium, bijvoorbeeld Williams 'E (Sigma), 5% foetaal runderserum (Hyclone,), 0,5 ^ml-1 U insuline (Eli Lilly), 20 ng ^ml-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ^ml-1 glucagon (Bedford Laboratories), 7,5 ug ^ml-1 hydrocortison (Pharmacia), 100 U ^ml-1 penicilline en 100 ug ^ml-1 streptomycine (Invitrogen).
2. Plaats de recellularized lever transplantaat in de perfusie kamer en sluit de DLM om de perfusie-systeem via de poortader canule, terwijl de pomp draait op 5 ml / min tot de vorming van eventuele luchtbellen te voorkomen.
3. Aseptisch sluit de perfusie kamer en zegel strak om lekkage tijdens de cultuur te vermijden.
4. Breng de perfusie-systeem om een incubator die is 37 ^o C en 10% CO ₂ en verhoging van de perfusie debiet tot 15 ml / min.
5. Sluit de oxygenator tot een 95% O ₂ en 5% CO ₂ gasmengsel tank en zet het gas debiet tot 0,5 liter / min. Dit moet bereikt een partiële zuurstofdruk van de onderlingetely 400 mmHg.
6. De cultuur kan blijven tot 10 dagen met de dagelijkse veranderingen van de cultuur medium. Het kweekmedium kan dagelijks worden bemonsterd voor de bewaking van de lever functies van het transplantaat zoals albumine, ureum en totaal gal zuursecretie. Aan het einde van de cultuur periode mag de recellularized lever transplantatie worden bemonsterd voor moleculaire en histologische analyse.

4. Representatieve resultaten:

De volledige decellularisatie van een rat duurt ongeveer 72 uur met de beschreven protocol. De resulterende matrix behoudt 100% van het collagenen, 50% van de glycosaminoglycanen en slechts 5% van het DNA van de inheemse lever (tabel 1) ^6. De vasculaire structuur van de matrix is bewaard gebleven, zoals blijkt uit corrosie gieten en scanning elektronenmicroscopie analyse (figuur 4) ^6. De aanwezigheid van de vasculaire microarchitectuur binnen de DLM faciliteert haar herpopulatie met cellen met een rendement van 96% en de latere perfusie voor in vitro cultuur. De recellularized lever transplantatie kunnen worden gekweekt tot 10 dagen in vitro en geeft een goede lever functioneert als bevestigd via albumine, ureum en totaal galzuur secretie (figuur 5) ^6.

Figuur 1. Gedecellulariseerde lever matrix aan het einde van het decellularisatie proces. (A) de gehele lever (b) de mediane lob na resectie.

Figuur 2. Schematische weergave van de recellularization van het DLM.

Figuur 3. Perfusie-systeem setup voor in vitro cultuur van de recellularized lever transplantaat.

Figuur 4. De microvasculaire structuur is behouden in de gedecellulariseerde lever matrix. Corrosie gegoten beelden van een), een normale lever b) een gedecellulariseerde lever, portal (rood) en veneuze (blauw) vaatstelsel. Scanning elektronenmicroscopie beelden van het DLM c) een schip, d) een deel met galweg-achtige kleine schepen (pijlen), Schaal bars (a, b) 5 mm (c, d) 20 micrometer.

Figuur 5. Lever specifieke functies van de lever recellularized graft tijdens de perfusie in vitro cultuur. a) albumine secretie (p = 0,5249), b) ureum productie (p = 0,5271) en c) het totaal gal zuursecretie (p = 0,0114). Statistische analyse van het verschil tussen het experiment en de controle werd uitgevoerd op de 10 d cultuur periode door te testen Friedman's op a = 0.01. Foutbalken geven sem (n = 3).

Tabel 1. De biochemische samenstelling van het gedecellulariseerde lever matrix ten opzichte van de autochtone lever.
^een Waarden zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM

De perfusie decellularisatie hier beschreven methode levert een hele lever steiger die dezelfde grove structuur en de vasculaire microarchitectuur van de inheemse lever heeft. De steiger heeft een extracellulaire matrix samenstelling vergelijkbaar is met de inheemse lever. De recellularization methode bereikt herbevolking van de steiger met cellen bij hoge rendement en de cellen blijven haalbare en functionele tijdens de in vitro geteste cultuur periode. Met de toevoeging van nonparenchymal cellen in de lever recellularized transplantaat, zien wij dat de recellularized lever transplantatie kan worden gebruikt als een platform om verschillende lever-functies, zoals metabolisme, herstel en ontwikkeling te bestuderen. Bovendien kan de recellularized transplantaat vinden klinische toepassing, omdat het kan mogelijk worden getransplanteerd via aansluiting op de doorbloeding van een ontvanger dier dankzij de aanwezigheid van vasculaire structuur in het transplantaat ^6.