Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

1. Liver Dezellularisierung

1. Ernte einer Rattenleber mit Pfortader Kanülierung mit und 18-Gauge-Katheter. Lassen Sie die untere und obere Hohlvene zu öffnen. Halten Sie die Orgel hydratisiert in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 10-cm-Petrischale.
2. Einrichten einer Perfusion System, das von 8-Liter-Behälter, Schlauchpumpe und einer Blasenfalle besteht.
3. Füllen Sie die Perfusion mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und halten Sie es läuft für 10 Minuten. Füllen PBS in einem 10-cm-Petrischale und reduzieren die Fließgeschwindigkeit des Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zu 1 mL / min.
4. Sorgfältig Übertragung der geernteten Leber zu den Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gefüllt 10-cm-Petrischale.
5. Fahren Sie mit PBS Perfusion über Nacht.
6. Starten Perfusion mit 0,01% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) in destilliertem Wasser für 5 Minuten.
7. Perfundieren mit PBS für 1 Stunde.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1,6 und 1,7 noch dreimal die Erhöhung der SDS Perfusion auf 10, 15 und 20 Minuten zu jeder Zeit.
9. Weiter Perfusion mit 0,01% (w / v) SDS für 24 Stunden.
10. Weiter Perfusion mit 0,1% (w / v) SDS für 24 Stunden.
11. Perfundieren mit 0,2% (w / v) SDS für 3 Stunden.
12. Perfundieren mit 0,5% (w / v) SDS für 3 Stunden.
13. Perfundieren mit destilliertem Wasser für 15 Minuten.
14. Perfundieren mit 1% (w / v) Triton X-100 in destilliertem Wasser für 30 Minuten keine gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen.
15. Zum Waschen der dezellularisierte Leber-Matrix (DLM), perfuse mit PBS für 2 Stunden.
16. Optional: reseziert allen Lappen mit Ausnahme der Mittellappen.
17. Bewahren Sie die DLM in einer sauberen und verschlossenen Petrischale in PBS bei 4 ^o C eingeweicht, bis sie verwendet (Abbildung 1).
18. Um sterilisieren DLM: 1) Spülen Sie die DLM mit sterilem PBS mit 0,1% (v / v) Peressigsäure und 4% (v / v) Ethanol und Inkubation für 3 Stunden bei 4 ^o C. 2) mit sterilem PBS 2 mal waschen. 3) mit sterilem PBS mit 2% Penicillin-Streptomycin, 10ug / mL Gentamicin und 2,5 ug / ml Amphotericin B. Bewahren Sie die dezellularisierte Leber in der gleichen Lösung bei 4 ^o C bis bereit, für recellularization Experimenten Wash.

2. Recellularization von dezellularisierte Leber Matrix

1. Einrichten einer Perfusion System, das von einer Perfusionskammer, Schlauchpumpe und einer Blasenfalle unter sterilen Bedingungen besteht. Füllen Sie die Perfusion mit 200 ml Kulturmedium, z. B. hohe Glukose-DMEM (Sigma), 10% fötalem Rinderserum (Hyclone,), 100 U mL ^-1 Penicillin und 100 ug mL ^-1 Streptomycin (Invitrogen).
2. Legen Sie die dezellularisierte Leber-Matrix in der Perfusionskammer und verbinden Sie die DLM die Perfusion System durch die Pfortader Kanüle, während die Pumpe mit 5 ml / min läuft, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
3. Lassen Perfusion des Mediums durch die DLM für 30 Minuten.
4. Isolieren primären Hepatozyten aus einer erwachsenen Ratte mit mindestens 90% Lebensfähigkeit.
5. Stoppen Sie die Strömung in der Perfusion und injizieren Sie langsam 50 Millionen Hepatozyten (in 1-3 ml Kulturmedium) in Perfusionssystem durch die Blasenfalle.
6. Starten Sie den Durchfluss bei 10 mL / min und rezirkulieren das Medium für 10 Minuten.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 bis insgesamt 200 Millionen Zellen in die DLM (Abbildung 2) ⁶ eingeführt werden.
8. Wenn alle Zellen in die DLM perfundiert werden, sammeln das Perfusat in vier 50-ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 600 rpm für 10 Minuten. Entsorgen Sie die Überstände und sammeln Sie die Pellets in einem einzigen Rohr. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und die Lebensfähigkeit über Trypanblau-Ausschluss für die Aussaat Effizienz zu bestimmen.

3. In-vitro-Kultur der Recellularized Leber Graft

1. Einrichten einer Perfusion System, das von einer Perfusionskammer, Schlauchpumpe, Oxygenator und eine Blasenfalle unter sterilen Bedingungen (Abbildung 3) besteht. Füllen Sie die Perfusion mit 50 ml Kulturmedium, z. B. Williams 'E (Sigma), 5% fötalem Rinderserum (Hyclone,), 0,5 U mL ^-1 Insulin (Eli Lilly), 20 ng mL ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng mL ^-1 Glukagon (Bedford Laboratories), 7,5 pg mL ^-1 Hydrocortison (Pharmacia), 100 U mL ^-1 Penicillin und 100 ug mL ^-1 Streptomycin (Invitrogen).
2. Legen Sie die recellularized Lebertransplantation in der Perfusionskammer und verbinden Sie die DLM die Perfusion System durch die Pfortader Kanüle, während die Pumpe mit 5 ml / min läuft, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
3. Aseptischen Bedingungen in der Nähe der Perfusionskammer und dicht schließen, um ein Auslaufen während der Kultur zu vermeiden.
4. Übertragen Sie die Perfusion System in einen Inkubator, dass 37 ^o C ist und 10% CO ₂ und erhöhen die Perfusionsflussrate bis 15 mL / min.
5. Verbinden Sie den Oxygenator zu einem 95% O ₂ und 5% CO _2-Gasgemisch Tank und stellen Sie den Gas-Durchfluss bis 0,5 Liter / min. Dies sollte erreicht eine Sauerstoff-Partialdruck von NaherungTely 400 mmHg.
6. Die Kultur kann bis zu 10 Tagen mit täglich wechselnden Kulturmedium weiter. Das Kulturmedium kann täglich zur Überwachung der Leberfunktion des Transplantats, wie Albumin, Harnstoff und insgesamt Gallensäure Sekretion abgetastet werden. Am Ende der Kultur Frist kann der recellularized Lebertransplantation für molekulare und histologische Analyse beprobt werden.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Die komplette Dezellularisierung einer Rattenleber dauert etwa 72 Stunden mit dem beschriebenen Protokoll. Die resultierende Matrix behält 100% der fibrillären Kollagen, 50% der Glykosaminoglykane und nur 5% der DNA des nativen Leber (Tabelle 1) ^6. Die vaskuläre Struktur der Matrix bleibt erhalten, wie durch Korrosion Gieß-und Rasterelektronenmikroskopie Analyse (Abbildung 4) ⁶ belegt. Die Anwesenheit des vaskulären Mikroarchitektur innerhalb der DLM erleichtert die Wiederbesiedlung mit Zellen mit einem Wirkungsgrad von 96% und die anschließende Perfusion in vitro-Kultur. Die recellularized Leber Transplantat kann bis zu 10 Tage in vitro kultiviert werden und zeigt geeignete Leber funktioniert als über Albumin, Harnstoff und insgesamt Gallensäure Sekretion (Abbildung 5) ⁶ bestätigt.

Abbildung 1. Dezellularisierte Leber-Matrix am Ende des Dezellularisierung Prozess. (A) die ganze Leber (b) der Mittellappen nach Resektion.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der recellularization der DLM.

Abbildung 3. Perfusion System-Setup für In-vitro-Kultur der recellularized Lebertransplantation.

Abbildung 4. Die mikrovaskuläre Struktur wird in der Leber dezellularisierte Matrix beibehalten. Ausgusspräparat Bilder aus a) einer normalen Leber b) eine dezellularisierte Leber-, Portal-(rot) und venösen (blau) Gefäßsystem. Rasterelektronenmikroskopie Bilder des DLM c) ein Gefäß, d) ein Abschnitt mit Gallengang-like kleinen Gefäße (Pfeile), Scale Bars (a, b) 5 mm (c, d) 20 um.

Abbildung 5. Liver spezifischen Funktionen des recellularized Lebertransplantation während der in vitro Perfusion Kultur. a) Albumin-Sekretion (p = 0,5249), b) zur Herstellung von Harnstoff (p = 0,5271) und c) insgesamt Gallensäure-Sekretion (p = 0.0114). Die statistische Analyse der Differenz zwischen dem Experiment und der Kontrolle wurde über die 10 d Kultur Zeitraum von Friedman-Test bei a = 0,01 durchgeführt. Fehlerbalken stellen sem (n = 3).

Tabelle 1. Die biochemische Zusammensetzung der dezellularisierte Leber-Matrix auf die native Leber verglichen.
^a Werte werden als Mittelwert ± SEM dargestellt

Die Perfusion Dezellularisierung hier beschriebene Methode produziert eine ganze Leber Gerüst, das die gleiche grobe Struktur und die vaskuläre Mikroarchitektur des nativen Leber hat. Das Gerüst hat eine extrazelluläre Matrix Zusammensetzung ähnlich der nativen Leber. Die recellularization Methode erreicht Wiederbesiedlung des Gerüsts mit Zellen mit hohem Wirkungsgrad und die Zellen lebensfähig bleiben und funktionelle während der in vitro-Kultur Zeitraum getestet. Mit dem Zusatz von nonparenchymal Zellen in die Leber recellularized Transplantat, planen wir, dass die recellularized Lebertransplantation als Plattform für die verschiedenen Funktionen der Leber, wie Arzneimittel-Metabolismus, Regeneration und Entwicklung Studie verwendet werden. Darüber hinaus kann der recellularized Transplantat zu finden klinische Anwendung, denn es kann möglicherweise durch den Anschluss an den Blutkreislauf des Empfängers Tier dank der Anwesenheit von vaskulären Strukturen in das Transplantat ⁶ transplantiert werden.