人类神经干细胞转染与Amaxa Nucleofector

注：请参阅的传代人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）和点票人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com /指数/ Details.stp？ID = 262 ），以了解如何重悬并计数hNSPCs。

制备

1. 确保有大量可用于转染的细胞（几百万的每个DNA的细胞转染）。
2. 外套的组织培养皿中，融入其中，转染细胞接种10μg/ ml的人纤维连接蛋白转染前的晚上，。前开始转协议，取出的纤维连接蛋白，用PBS漂洗的菜，菜的地方文化传媒。离开菜在37℃组织培养孵化器温暖的媒体。另外，在孵化器中放置1毫升培养基预温至37 ° C。
3. 将DNA（S）转染和转染的解决方案（从Amaxa）在冰上。

转

1. 洗一个细胞，用PBS（我们通常使用〜5 × 106个细胞，每转）定义的数字。离心（1000转（〜200xg）5分钟）的颗粒细胞，取出尽可能PBS，重悬细胞沉淀在100μL转染试剂盒提供的转染的解决方案。将细胞悬液1.7 mL Eppendorf管。
2. 加入细胞悬液5μL的DNA（〜5-10微克每转染DNA），轻轻混匀。
3. 使用Amaxa迷你移液器，转移到Amaxa转比色皿的细胞DNA的混合。请确保您有1毫升预热的培养基，为下一步。此外，去除细胞菜文化传媒从孵化器，并放置在组织文化罩。
4. 放入试管的Nucleofector，顺时针旋转的车轮，并选择计划的“A - 033”。 按 Enter键。
5. 解决在试管上非常密集的气泡层的存在是一个成功的转表示。添加到试管500μL温暖的媒体，并使用Amaxa微型吸管，转移到碟预热媒体转染细胞。清洗比色皿更热烈媒体和添加冲洗，以同样的菜。放置在37℃组织培养箱内培养细胞的菜。

这一协议描述为hNSPCs相对快速，高效的的转染过程。使用此过程中，我们已取得了初始转染效率〜35％。此过程中的转染细胞，可用于短期研究（瞬时转染的细胞）或较长期的研究中，如果选择代理是用来产生一个稳定转染的人口。我们已经产生了稳定转染的细胞在其中〜70％的细胞表达外源蛋白。在瞬时转染hNSPCs，我们所观察到的〜7天的外源蛋白的持续表达。