Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

注：継代ヒト神経幹細胞の記事（への参照http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）とカウントヒト神経幹細胞の記事（ http://www.jove.com /インデックス/ Details.stp？ID = 262 hNSPCsを再懸濁し、カウントする方法を学ぶ）。

準備

1. トランスフェクションのための使用可能なセル（各DNAは数百万の細胞がトランスフェクトされる）の多くがあることを確認してください。
2. コー​​トトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの前に夜10μg/ mlのヒトフィブロネクチンと、シードされるに組織培養皿を、。右のトランスフェクションプロトコールを開始する前に、、フィブロネクチンを除去PBSで皿を洗い、そして皿の場所の培養培地。メディアを温めるために37℃の組織培養インキュベーターで皿を残す。また、37〜プレ暖かい℃にインキュベーターで培養培地1 mlを置く
3. 氷の上に、トランスフェクトされるDNA（S）、およびトランスフェクション溶液を（Amaxaから）に置きます。

トランスフェクション

1. PBSで細胞（我々は通常、トランスフェクションあたり〜5 × 106細胞を使用する）の定義の数を洗ってください。ペレットを遠心分離（1000 rpm 5分間（〜200xg））によって細胞、できるだけ多くのPBSと削除、およびトランスフェクションキットに付属のトランスフェクション溶液100μlに細胞ペレットを再懸濁します。 1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに細胞懸濁液を移す。
2. 細胞懸濁液にDNAを5μl（トランスフェクションあたりのDNAの5〜10μg）を加え、穏やかに混ぜる。
3. Amaxaミニピペットを使用して、Amaxaのトランスフェクションのキュベットに細胞- DNA混合物を転送する。あなたが次のステップのための予め温めておいた培地1 mlを持っていることを確認してください。また、インキュベーターから培養培地で細胞の皿を削除し、組織培養フードに入れてください。
4. Nucleofectorにキュベットを置き、ホイールを時計回りに回転させ、プログラム"A - 033"を選択します。 Enterキーを押します。
5. 成功したトランスフェクションは、キュベット内の溶液の上に泡の非常に緻密層の存在によって示されます。キュベットに500μlの暖かいメディアを追加する、とAmaxaミニピペットを用いて、予め温めておいた培地とシャーレにトランスフェクションされた細胞を移す。より暖かいメディアとキュベットをすすぎ、同じ皿にリンスを追加。 37℃の組織培養インキュベーターで細胞と皿を置きます。

このプロトコルは、hNSPCsため、比較的迅速かつ効率的なトランスフェクションの手順を説明します。この手順を使用して、我々は、〜35％の初期のトランスフェクション効率を得ている。選択剤が安定にトランスフェクトされた人口を生成するために使用されている場合は、この手順でトランスフェクトした細胞は、短期試験（過渡的にトランスフェクションした細胞）のためにまたは長期的な研究に使用することができます。我々は、外来タンパク質を発現する細胞の70％を〜する安定にトランスフェクト細胞を生成している。一過性にトランスフェクトhNSPCsでは、我々は〜7日間のための外因性蛋白質の継続的な発現を観察した。