Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Nota: Consulte o artigo Neural Stem Passaging Humanos Cells ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ea Human Neural Stem Contando artigo Cells ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs.

Preparação

1. Certifique-se que há uma abundância de células disponíveis para transfecção (vários milhões de células para cada DNA a ser transfectadas).
2. Revestimento de um prato de cultura de tecidos, no qual as células transfectadas serão distribuídos, com 10 mg / ml fibronectina humana na noite anterior transfecção. Direito antes de iniciar o protocolo de transfecção, remova a fibronectina, lavar o prato com PBS, e media o lugar da cultura no prato. Deixe o prato no 37 ° C a cultura de tecidos incubadora para aquecer a mídia. Além disso, coloque 1 ml de meios de cultura na incubadora para pré-aquecer a 37 ° C.
3. Coloque o DNA (s) a ser transfectadas, e solução de transfecção (de Amaxa), sobre o gelo.

Transfecção

1. Lavar um número definido de células com PBS (geralmente usamos ~ 5 x 106 células por transfecção). Agregar as células por centrifugação (1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos), retire como PBS tanto quanto possível, e ressuspender o pellet celular em 100 ml da solução de transfecção fornecido com o kit de transfecção. Transferir a suspensão de célula para um tubo eppendorf 1,7 ml.
2. Adicionar 5 l do DNA (~ 5-10 mg de DNA por transfecção) para a suspensão de células e misture delicadamente.
3. Usando o Amaxa mini-pipeta, transferir a mistura de células-DNA na cuvete transfecção Amaxa. Certifique-se que 1 ml de mídia pré-aquecido a cultura para a próxima etapa. Além disso, remova o prato com meios de cultura de células da incubadora e colocá-la na capa de cultura de tecidos.
4. Coloque a cuvete no Nucleofector, gire a roda no sentido horário, e seleccione programa "A-033". Pressione Enter.
5. A transfecção de sucesso é indicada pela presença de uma camada muito densa de bolhas no topo da solução na cuvete. Adicionar 500 mL de mídia quente na cuvete, e usando o Amaxa mini-pipeta, transferir as células transfectadas no prato com pré-aquecido mídia. Lavar a cuvete com a mídia mais morna e adicione a água para o mesmo prato. Coloque o prato com as células do tecido 37 ° C a cultura incubadora.

Este protocolo descreve um procedimento de transfecção relativamente rápida e eficiente para hNSPCs. Usando este procedimento, obtivemos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35%. Células transfectadas por este procedimento pode ser usado para estudos de curto prazo (células transfectadas transitoriamente) ou para estudos de longo prazo se um agente de seleção é usado para gerar uma população estável transfectadas. Geramos células transfectadas estavelmente em que ~ 70% das células expressam a proteína exógena. Em hNSPCs transitoriamente transfectadas, temos observado expressão da proteína continuou exógena para a 7 dias.