一个负选择标记的发展阿米巴

Mayuresh M Abhyankar, Sarah M Haviland, Carol A Gilchrist, William A Petri, Jr.

Division of Infectious Disease and International Health, University of Virginia Health System

1。风机盘管阿米巴负选择系统

1. 矢量控制线（HM1 / pKT3M）和实验线（HM1/pKT3M-FCU1）产生先前所描述的技术^1,2。种子行股票管到的T - 25培养瓶，正在研究并保持缇S ^{- 33} 3培养基中加入适当的抗生素（12微克/毫升G418）的选择。烧瓶应后16-18小时，增长70％至80％汇合，在37 ° C。
2. 准备在温暖缇S - 33中的5 - 氟胞嘧啶（5 - FC，Sigma公司）的新鲜50MM原液。涡严格几分钟完全解散5 - FC。通过一个0.22微米的过滤器，过滤，消毒原液。
3. 收获的烧瓶放置在冰3-5分钟，收集细胞，离心5分钟，在室温在200xg滋养体。重悬沉淀在新鲜缇介质和细胞计数。
4. 一个典型的实验设计采用在最终体积为1 mL 0.5 × 10 ^4％和48孔板的细胞，一式三份重复，并为每个测试条件。此外，为方便荧光测量，一个单独的板块是用来为每人时间点的压力。
5. 种子0.5 × 10 ⁴细胞的每个测试的5 - FC浓度，一式三份，每口井。保持在缇介质的抗生素选择压力。现在加入5 - FC股票的解决方案，并每口井滋养体，所需金额。
6. 在厌氧袋板在37 ° C。

2。选择效率的测定

1. 准备2毫克/毫升细胞跟踪绿色CMFDA（Invitrogen公司）在DMSO原液。为了使工作液稀释1000倍，在无血清缇中等的股票。
2. 取出介质完全从滋养体培养板和150μL无血清缇含有CMFDA更换。继续孵化，在37 ° C为1小时。
3. 从水井中取出的染料溶液和Spectramax M2微孔板分光光度计读取的板块。应设置激发波长在492 nm处，荧光光谱在517 nm处读取。
4. 比较与测试转染对照组细胞的荧光值。
5. 继续阅读在每个时间间隔板块。在每盘使用适当的阳性（缇只）和负（25微克/ mL潮霉素）控制井。

3。代表性的成果

的大肠杆菌阿米巴转染密码子优化重组FCU1（图1）显示了强劲的表达，当这个协议是正确遵循E.选择性消除它的结果阿米巴细胞表达为0.5毫米5 -氟胞嘧啶存在FCU1。控制细胞，继续在对比正常生长至5毫米5 - FC浓度，达到72和96小时之间的汇合（图2 - A）。 FCU1进行48小时的细胞完全裂​​解处理井时，在显微镜下看。这些也显示下降的荧光时至关重要的，这是涉及大量的样品（图2 - B）的定量研究中使用的染料CMFDA染色。 FCU1/5-FC系统是一个有效和强大的的的E.负选择工具阿米巴滋养体。

图1。生成的E.阿米巴 HM1表达负选择标记的转染
（ 一 ）FCU1重组蛋白被发现使用抗c Myc抗体（顶部面板）在西部印迹。正如预期的那样，可以检测到一个42kDa带，在从FCU转染的总裂解（箭头所示），但没有单独的矢量控制转染。底部面板上显示相同的印迹与抗肌动蛋白抗体检测作为加载控制。 （二）定量实时PCR结果显示FCU1具体归lgl4控制的mRNA表达。

图2。 体外E.药物的敏感性阿米巴表达负选择标记的转染
（ 一 ）控制转染及（b）FCU1表达转染48孔板培养的生存曲线。细胞生长浓度的增加，存在的前体药物5 - 氟胞嘧啶; CMFDA染色细胞的存活在每个时间间隔量化X轴表示。 Y轴代表荧光单位，是一个幸存的细胞群的直接反映。请注意FCU1表达转染表明，在0.5mm的前体药物浓度显着的灵敏度比对照。没有观察细胞在这些井为COM 120H时间点相比汇合增长在显微镜下相应的控制井（数据未显示）看到。湿度计表示25μg/ mL潮霉素作为阴性对照。