Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

1, 2, 1

1Institute of Healthy Ageing, and GEE, University College London - UCL, 2School of Biosciences, University of Kent

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412, doi:10.3791/2412 (2011).

Abstract: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

När skrämd vuxna D. melanogaster reagerar genom att hoppa i luften och flyger iväg. I många ryggradslösa djur, inklusive D. melanogaster, den "fly" (eller "skrämma") svar under den vuxna scenen medieras av flera komponenter neuronala kretsar kallas Giant Fiber System (GFS). Den jämförande stora storlek nervceller och deras särskilda morfologi och enkla anslutningsmöjligheter gör GFS en attraktiv modell för att studera neuronala kretsar. GFS väg består av två bilateralt symmetriska (GF) Giant Fiber interneuronen vars axoner ner från hjärnan längs mittlinjen i bröstkorg ganglion via livmoderhalsen bindväv. I mesothoracic neuromere (T2) av den ventrala ganglierna GFS formen elektrokemisk synapserna med 1) den stora mediala Dendrite av ipsilaterala motorneuron (TTMn) som driver tergotrochanteral muskeln (TTM), den viktigaste extensor för mesothoracic lårbenet / ben och 2) den kontralaterala perifert synapsing interneuron (PSI) som i sin tur kemiska former (kolinerga) synapser med motorneurons (DLMns) i rygg längsgående musklerna (DLMS), vingen depressors. Den neuronala vägen (s) till dorsovental musklerna (DVMs), vingen hissar, har ännu inte fungerat (det DLMS och DVMs kallas gemensamt som indirekta flyg muskler - de är inte monteras direkt på vingarna, utan i stället flytta vingar indirekt genom att förvränga den närliggande bröstkorg nagelband) (King och Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). Den di-synaptisk aktivering av DLMS (via PSI) orsakar en liten men viktig försening i tidpunkten för sammandragning av dessa muskler i förhållande till monosynaptic aktivering av TTM (~ 0,5 ms) låta TTMs att först förlänga lårbenet och driva flyga från marken. Den TTMs samtidigt stretch-aktivera DLMS som i sin tur varandra stretch-aktivera DVMs under hela flygningen. GF vägen kan aktiveras antingen indirekt genom att tillämpa en sensorisk (t.ex. "luft-puff" eller "ljus-off") stimulans, eller direkt av en överstatlig tröskel elektriska impulser till hjärnan (som beskrivs här). I båda fallen når en aktionspotential i TTMs och DLMS endast via GFS, PSIs och TTM / DLM motoneurons, även om TTMns och DLMns har andra, ännu oidentifierade, sensoriska ingångar. Mätning "latency svar" (tiden mellan stimulans och muskel depolarisation) och "efter att högfrekventa stimulering" (antalet framgångsrika lösningar på ett visst antal högfrekventa stimuli) är ett sätt att reproducerbart och kvantitativt bedöma funktionella status av GFS komponenter, inklusive både centrala synapser (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) och kemiska (glutamaterg) neuromuskulära korsningar (TTMn-TTM och DLMn-DLM). Det har använts för att identifiera gener som är involverade i centrala synapsen bildning och bedöma CNS-funktion.

Protocol: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

1. Utrustning och material

  1. Dessa experiment använder en standard elektrofysiologi installation består av en stimulator, en stimulans isoleringsanläggningen, två förstärkare mikroelektrod, ett datainsamlingssystem och en dator med samling programvara. Ytterligare utrustning inkluderar en Faradays bur, ett stereomikroskop på en bom stativ, en vibrationsisolering bord, en ljuskälla, och en inspelning plattform.
  2. Fem micromanipulators används. Två micromanipulators kräver bra kontroller för positionering inspelningen elektroder, medan de övriga tre micromanipulators endast kräver grov kontroller för att placera två stimulans elektroder och marken elektroden. Den mikromanipulator för DLM inspelning elektroden är placerad vid svansen slutet av beredningen (till vänster om försöksledaren) och mikromanipulator för TTM inspelning elektroden är placerad mellan försöksledaren och den sida av preparatet (något till vänster om försöksledaren). De två micromanipulators som kommer att hålla simuleringen elektroder placeras i spetsen av preparatet (rätt försöksledaren). Den mikromanipulator för jordelektroden är placerad vid bortre sidan av preparatet
  3. Dra microelectrodes glas inspelning med motstånd på 40-60 Mohm och lagra plant i en maträtt som stöds av vax. För stimulering, två elektrolytiskt (NaOH) vässade volframelektroder används. En volfram tråd, eller en tredje elektrolytiskt påhittade elektrod används som grund. Den stimulerande och jordelektroder är beredda och knytas till micromanipulators innan den experimentella sessionen och behöver inte bytas ut under hela sessionen.

2. Förbereda D. melanogaster

  1. När din utrustning är inställd, är det dags att förbereda sig flugorna. Bedöva flugorna genom att kyla dem is eller med hjälp av CO 2. Om CO 2 används, tillräckligt med tid (ca 20 min) för effekterna av gasen avta innan du påbörjar experimentet.
  2. Använd pincett för att överföra flugor försiktigt genom sina ben till en maträtt som innehåller en plattform av mjukt vax lutande i en vinkel på ca 45 °. De följande fyra stegen görs under ett dissekera mikroskop bort från (men nära) i färdskrivaren.
  3. Nästa steg är att trygga flyga i vax. Orient flugan ventrala nedåt, med sin främre uppåt på sluttningen. Använda ett par fina tång, förlänga benen utåt, i par, och skjut dem i vax.
  4. Bekanta dig med var de muskler som skall spelas från: ryggstycket längsgående muskler, eller DLM och tergotrochanteral muskler, eller TTM. Den subcutan infästning i nätverket DLMS överensstämmer med regionen mellan bröstkorg mittlinjen och den främre rygg borst (eller hårkanten). TTM bifogade platser är belägna dorsalt i bakre och främre överstatlig Alar borst. Att se till att vingarna inte hindrar tillgång till DLM eller TTM fibrer, håller vingarna utåt och "limma" dem med vax.
  5. Använda en fin pincett, dra snabel utåt noga och säkra den genom att sänka ned den i vax. Detta är ett kritiskt steg som kräver lite övning eftersom snabel är mjuk och är lätt loss från resten av huvudet. Om det händer, kassera flyga och börja om. Underlåtenhet att säkra huvudet på detta sätt leder till problem när du sätter den stimulerande elektroder genom ögonen.

3. Placering av elektroderna

  1. När flugan är förankrad i vax, överföra skålen med den bifogade flyga under stereomikroskop som är placerad inuti Faradays bur. Orientera flyger i sidled med huvudet för att flyga till höger om försöksledaren.
  2. Nästa steg är att sätta elektroderna. Jord och stimulerande elektroder kan föras in utan att titta i mikroskopet. Bra inspelningar är beroende av precisa impalement, så det är en bra idé att öva hantering av micromanipulators. Ta elektroderna nära platser för insättning med hjälp av micromanipulators att underlätta korrekt placering och efterföljande inspelningar.
  3. Sänk jordelektroden i den bakre änden av buken med hjälp av justeringen hjulen på mikromanipulator. För att placera vässade volfram stimulerande elektroder i hjärnan, använd mikromanipulator att placera spetsen på en av elektroderna så att det bara rör en av flugans ögon. Gör likadant med den andra så att båda elektroderna är precis når utanför varje öga. Tryck sedan in elektroder i sin tur, genom varje öga så de tips av elektroderna nå hjärnan som ligger på baksidan av huvudet kapsel (ca 2-3mm).
  4. Rätt placerade elektroder kommer att aktivera Giant Fiber System. För att testa att stimulerande elektroder placeras på rätt sätt, använda en kort (0,03 ms) stimulans av 30-60V över stimulerande elektroder, och leta efter rörelsen av vingar och ryckningar av flygningen / benet muskler "
  5. Nästa steg är att back-fylla glaset microelectrodes med 3M KCl hjälp av en Hamilton eller värme-drog plastspruta, och placera dem i fina kontroll micromanipulators. Ordentligt microelectrodes kan användas för flera rundor av experiment.
  6. Den första inspelningen elektroden kommer att införas i en DLM fiber. Det finns två bilateralt symmetrisk DLMS, var och en består av sex enskilda muskelfibrer. Inspelningarna kan göras från någon av de sex fibrer, men de vanligaste är DLM fibrer 45a och 45b på deras goda tillgänglighet genom den dorsala sidan av bröstkorg nagelband, och det faktum att båda fibrer är innerveras av samma motorneuron .
  7. Använda mikromanipulator på sidan längst bort från dig, sätter en inspelning elektroden i DLM fibrer 45a eller b. Lutningen på plattformen gör det möjligt för DLM elektroden att gå in i ryggens nagelband på en ~ 60-90 ° vinkel, vilket underlättar penetration. Använda programvaran i oscilloskopet läge och titta på datorskärmen när du sätter in elektroder i bröstkorgen. När elektroden har gått in i en muskel baslinjen kommer att sjunka till nära noll eller ett negativt värde. Testa med en stimulans för att se om du kan observera muskeln svar.
  8. Sätt i den andra inspelningen elektrod i TTM närmast dig. Denna elektrod sätts sidled framför dig, på grund av placeringen av muskeln applikationsstället. Återigen observera monitorn medan du gör detta och testa med en enda stimulans när spår visar elektroden i muskeln.

4. Stimulans och inspelning

  1. Du är nu redo att börja stimulera hjärnan och svar inspelning från benet och musklerna flygning. Applicera en kort (0,03 ms) stimulans över stimulerande elektroder börjar vid 30 V och ökar till 60 V tills du observerar en respons (dvs. en muskelryckningar, och en muskelcell depolarisation som observerats på datorskärmen). För resten av försöket, som den spänning 5-10 V ovan svaret tröskeln.
  2. För att mäta respons latens, ge minst 5 enstaka stimuli med 5 sekunders vila mellan varje stimulus.
  3. Bestäm "frekvensen av följande" genom att tågen av stimuli i olika takt. Typiskt 10 tåg av 10 stimuli ges i 100 Hz (10ms mellan varje stimulus), 200Hz (5ms mellan varje stimulus) och 300Hz (3 ms mellan varje stimulus). Låt en viloperiod på 2 sekunder mellan varje tåg av stimuli.

5. Resultat: Response latency och frekvens Efter i Giant Fiber Pathway

  1. Svaret fördröjning är tiden mellan stimulering av hjärnan och depolarisation av muskeln. Denna siffra kan jämföras svaret latenser för DLM och TTM till en enda stimulans. Latenser mellan 0,7 och 1,2 ms för GF-TTM vägen och mellan 1,3 och 1,7 ms för GF-DLM väg tyder på en hälsosam förberedelserna och inspelningsteknik. Den latenser kan variera med genotyp, genetisk bakgrund, temperatur och ålder.

    Figur 1 (A och B). Representant spår som visar svaren in från TTMs och DLMS efter en stimulans som tillämpas på hjärnan.
  2. Som visas här, inspelningar från TTM visa större variation i termer av amplitud och form postsynaptiska potentialen (PSP) jämfört med dem från de stora DLM fibrer, denna ökade variation beror på att den lilla storleken på TTM muskelfibrerna. Denna variation är dock inte påverkar de värden respons latens för Giant Fiber-to-TTM väg.

    Figur 1 (C och D). Ytterligare svar latency "spår från 4 individuella flugor för både TTM och DLM. Observera TTM spår uppvisar variationer i PSP-form men svaret latens är opåverkad. För DLM det finns mindre variationer i PSP form.

    Figur 1 A-D

  3. Jämför "frekvensen av följande" vid 100 Hz, 200 Hz och 300 Hz genom att beräkna andelen lyckade svar (av 10) för både DLM och TTM vägar vid varje stimulering frekvens. Vid 100 Hz, både TTM och DLM följ stimuli 01:01. Vid stimulering frekvenser över 100 Hz, DLM svaren börjar visa fel, eftersom den förmedlande kemiska synapsen mellan två interneuronen inte har tillräckligt med tid att återhämta sig mellan stimuli. TTM svar, dock fortfarande 1:1 med stimuli även utanför 300Hz.

    Figur 2. Representant spår som visar "frekvensen av följande" inspelningar. Vid 100 Hz, både TTMs och DLMS svara på alla 10 stimuli (till vänster). Vid 200 Hz, den DLM svaren börjar misslyckas (asterisk).

    Figur 2

6. Representativa resultat

Vildtyp kort latens svar (stimulerad elektroder placeras i ögonen, förbi sensoriska receptorer och utlöser GF kretsen direkt) beror på genotyp, genetisk bakgrund, temperatur och ålder, och ligga mellan 0,7 och 1,2 ms för GF-TTM vägen och 1,3 and1.7 ms för GF-DLM vägen (Tanouye och Wyman, 1980, Thomas och Wyman, 1984; Engel och Wu, 1992; Allen och Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, opublicerad). . Denna mycket korta TTM fördröjning beror på att den robusta GF-TTMn elektrokemiska synaps av monosynaptic vägen och längre DLM latens uppstår på grund av disynaptic typ av väg samt närvaron av en kemisk synaps (PSI-DLMn). Intermediate och lång latenstid svar (> 3 ms) resultatet av aktivering av GF afferenter och uppnås antingen genom att använda en lägre intensitet stimulering eller ge en visuell ("light-off") signal. Vid 100 Hz både TTM och DLM bör följa stimuli 01:01. Över 100Hz DLM svar kommer börja visa fel som den kemiska synapsen mellan PSI och DLMns inte har tillräckligt med tid att återhämta sig mellan stimuli mindre än 10ms isär. TTM svaren dock kommer att förbli 1:1 med stimuli även utanför 300Hz (Tanouye och Wyman, 1980, Engel och Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Mutationer i shakB genen kodar en Drosophila gap junction-kanal ("innexin"), kraftigt öka responsen latens av GF-TTM vägen (~ 1,5 ms) medan GF-DLM gren svarar inte (Allen och Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). Den muterade svar kan återställas genom att stimulera bröstkorg ganglier direkt, vilket visar att den fördröjda effekten inte beror på störd neuromuskulär transmission. Förmågan att följa högfrekvent stimulering är också nedsatt hos dessa mutanter jämfört med vildtyp flugor där GF-DLM och GF-TTM vägar brukar kunna följa 10 stimuli med förhållandet 1:1 upp till 100 Hz och 300 Hz, respektive. Det är viktigt att notera att dessa frekvenser är betydligt över det normala stimulans frekvenser tas emot av den upphandlande musklerna under den långvariga flygningar (3-10 Hz) (Hummon och Costello, 1989).

En annan parameter som används för att beskriva stabiliteten i GFS utgångarna är "refraktär period", eller den minimala tiden mellan två stimulans pulser som fortfarande producerar två svar från muskeln. Den eldfasta varierar mellan 1-4 ms för TTMs och 7-15 ms för DLMS. Den jämförelsevis långa refraktärperioden för DLMS beror på att relativt labil kemiska synapser i PSI-DLMn korsningen (Tanouye och Wyman, 1980; Gorczyca och Hall, 1984; Engel och Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen och Godenschwege, 2010).

Discussion: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

En av de viktigaste sakerna man måste ta hänsyn till när man försöker få hög kvalitet inspelningar är rätt inriktning och hälsa av preparatet. Helst ska flyga fortfarande vara vid liv i slutet av inspelningen och lyhörda för elektriska stimuli. För inspelning elektroderna mest effektivt penetrera bröstkorg exoskelett ska flyga limmas till ytan på ett sådant sätt att de bildar en rät vinkel med elektroderna, om nödvändigt, kan införandet av elektroder kan underlättas genom att ta bort en del av rygg bröstkorg nagelband med en tungsten skalpell utsätter därmed DLM flygningen muskeln (detta steg ger en ytterligare fördel att göra det svårare för de tips av glas elektroder att bryta). Dessutom måste försiktighet iakttas för att undvika att trycka elektroderna via subcuticularly ligger DLMS och TTMs. Chefen för flugan bör vara väl säkrade för att möjliggöra stimulerande elektroder vara ordentligt in i hjärnan och att hindra dem från att dras ut under inspelningen.

Tack vare sin storlek och väl beskrivna morfologi, representerar GFS en av de mest tillgängliga neuronala vägar i Drosophila. Permeabiliteten av elektriska synapser till små molekylära färgämnen vikt spårämne möjliggör visualisering av elektriskt kopplade nervceller, och flera tillgängliga GAL4 linjer gör det möjligt att manipulera nivåer genuttryck i en delmängd av celler eller grupper cell (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Förutom ovan nämnda fördelar, både afferenta och bröstkorg delar av fastigheterna kretsen visas som tillvänjning, spontan återhämtning och dishabituation, vilket gör Drosophila GFS ett bekvämt modellsystem för att studera neuronala plasticitet (Engel och Wu, 1996).

Disclosures: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

Detta arbete stöddes av en Wellcome Trust bidrag till LP

Materials: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

Name Company Catalog Number Comments
S48 Square Pulse Stimulator Grass Technologies
Stimulation unit Grass Technologies
SIU5 RF Transformer Isolation Unit Grass Technologies
5A two-channel intracellular Microelectrode Amplifier Getting Instruments, Inc.
Digidata 1440A data acquisition system Molecular Devices
Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software Molecular Devices
Recording platform with manual micromanipulators Narishige International
Light source Fostec
Wild M5 stereomicroscope Wild Heerbrugg
Vibration isolation table TMC
Borosilicate tubing for microelectrodes Sutter Instrument Co.
P-95 Micropipette puller Sutter Instrument Co.
Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) World Precision Instruments, Inc. MF34G-5
Microdissection tools (forceps,€¦) Fine Science Tools
Dissecting (stereo) microscope Leica Microsystems
Faraday cage Unknown
Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor...

References: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

  1. Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. In: Bing Zhang, Marc R. Freeman, Scott Wadde, Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual (1st Lab ed.) , Cold Spring Harbor Press, pp. (2010).
  2. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., et al. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol 17(1): 31-41 (2006).
  3. Allen, M. J., and Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter." Eur J Neurosci 26(2): 439-445 (2007).
  4. Banerjee, S., Lee, J. et al. Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila. J Neurosci 24(36): 7869-7878 (2004).
  5. Engel, J. E., and Wu, C. F. Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila. J Comp Physiol A 171(1): 93-104 (1992).
  6. Engel, J. E., and Wu, C. F. Altered habituation of an identified escape circuit in Drosophila memory mutants. J Neurosci 16(10): 3486-3499 .
  7. Gorczyca, M. and Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J Neurogenet 1(4): 289-313 (1984).
  8. Hummon, M. R., and Costello, W. J. Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers. J Neurobiol 20(6): 593-602 (1989).
  9. Jacobs, K., Todman, M. G., et al. Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target. Development 127(23): 5203-5212 (2000).
  10. King, D. G., and Wyman, R. J. Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway. J Neurocytol 9(6): 753-770 (1980).
  11. Martinez, V. G., Javadi, C. S., et al. Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila. Dev Neurobiol 67(6): 778-791 (2007).
  12. Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. In: M. Demerec, Editor, Biology of Drosophila (2nd ed.), (Hafner, New York) pp. 502-503 (1965).
  13. Phelan, P., Goulding, L. A., et al. Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system. Curr Biol 18(24): 1955-1960 (2008).
  14. Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster. J Comp Neurol 88(3): 347-409 (1948).
  15. Tanouye, M. A. and Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila." J Neurophysiol 44(2): 405-421 (1980).
  16. Thomas, J. B. and Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J Neurosci 4(2): 530-538 (1984).

Ask the Author: Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter