La estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica

0 día - La esterilización antes del día de experimento

1. Ponga los materiales en la tina de plástico y esterilizar con alcohol al 70% durante 2 horas:
   • Cámaras
   • Tapas
   • Marcos (las 3 piezas)
   • Tornillos
   • Las juntas de goma
   • Fórceps
   • Tijeras
   • Llaves hexagonales
2. Membranas limpia con agua y jabón Aquet destilada.
3. Sonicar membranas en alcohol al 70% durante 10 minutos.
4. Coloque las membranas de plástico limpia en platos cuadrados. Si se utiliza membranas de dibujos, asegúrese de que el lado estampado quede hacia arriba (alcohol spray en un lado de la membrana y velar por el líquido a correr por los surcos).
5. Deja membranas cubiertos en el 70% de alcohol durante 2 horas.
6. Guantes de paquete en papel de aluminio para autoclave mañana por la mañana.
7. Haga 2% (peso / volumen) solución de gelatina (2g/100mL) en agua destilada para el autoclave mañana.
8. Después de la esterilización de dos horas en el 70% de alcohol, coloque todos los materiales polímeros y las membranas (no autoclavable materiales) en la capilla de UV durante la noche:
   • Cámaras
   • Tapas
   • Marcos (las 3 piezas)
   • Membranas
9. Paquete de materiales sobrantes en una bolsa de autoclave:
   • Tornillos
   • Las juntas de goma
   • Fórceps
   • Tijeras
   • Llaves hexagonales

Día 1 - La Asamblea de las cámaras se extienden

1. Autoclave pinzas, tijeras, llaves hexagonales, tornillos, juntas, guantes, y la gelatina con autoclave pequeño 240 ° F durante 20 minutos en total
2. Quitar las membranas de los rayos UV y tratamiento con plasma de O ₂ (lado del patrón hacia arriba) de aproximadamente 1 minuto.
3. En la campana TC, cubrir el área de modelado de las membranas de plasma tratado con gelatina. Escudo de 30 minutos bajo los rayos UV.
4. Lavar cada membrana con PBS 2X. Después del lavado segunda, dejar un poco de PBS en las membranas de mantener más deslizantes, para facilitar el montaje en las cámaras. (También debe utilizar este PBS para lubricar las juntas para facilitar el montaje).
5. Montar las membranas en las cámaras (use guantes de autoclave durante el montaje)
   1. Conecte las dos piezas principales de la estructura con un solo tornillo.
   2. Da la vuelta al cuadro una y colocar una membrana en la parte superior para que las caras laterales recubiertos de gelatina hacia el bastidor (el área de modelado debe estar en el centro).
   3. Asegurar la membrana al marco mediante una junta en cada lado.
   4. Presione las juntas de, con suave, aunque la presión, a fin de no rasgar la membrana.
6. Adjuntar marco se reunieron para T-bar.
7. Voltear el marco y el lugar dentro de la cámara al revés. Parte posterior del bastidor UV y de la membrana durante 30 minutos
8. Voltear el marco de nuevo, y el tornillo en las cámaras (sin cambio de cámara de control, pero para la cámara de estiramiento, la necesidad de utilizar dos tornillos para sujetar la pieza final de la trama en la parte inferior de la cámara, y la necesidad de quitar el tornillo que se la celebración de las dos piezas de la estructura en conjunto). Parte frontal UV durante 30 minutos. Asegúrese de que las membranas estén completamente secas antes de proceder al siguiente paso, o de lo contrario la solución de células pueden deslizarse durante la siembra.
9. Las células de las semillas. Área de 1 = Área placa de 3 membranas, por lo que el uso 1 / 3 de una placa confluente por membrana. Use 1 ml de solución de células por la membrana. No más que 1,5 ml, será difícil mantener la solución en. Poner la solución única celda en el área de modelado, y el uso de la pipeta para extender la solución de todo. Cubrir las cámaras y dejar que las células conectar durante 30 minutos RT en el capó.
10. Mover las cámaras a la incubadora y dejar que las células de conectar por 1 hora más. Tener mucho cuidado en movimiento de las cámaras para evitar que la solución de células resbale! Las células en la cámara se arruinará si la solución se cae en este momento.
11. Volver a la campana de la cámara y agregar 20 ml de medio.
12. Cámaras en lugar de alcohol limpia tina que se cubre con papel de aluminio (también rociados con alcohol). Mover las cámaras para estirar la incubadora (10% CO _2).
13. Cámaras de seguro en la máquina de estiramiento. Deje que las células más adjuntar toda la noche, y empezar a estirar al día siguiente. (Nota: la hora de poner cámaras en la máquina de estirar, recuerde que debe cerrar la máquina en la posición "cero" antes de colocar las cámaras, y luego ajuste la banda de goma alrededor de los engranajes No te olvides de desbloquear los engranajes antes de iniciar la máquina.).

Banes et al. informó por primera vez el uso de un sistema de estimulación mecánica de las células in vitro mediante el uso de un sustrato de elastómero flexible para proporcionar la fuerza mecánica a las células ^1. Desde entonces, muchas variaciones en este diseño han sido concebidos y utilizados. Varios sistemas de estiramiento mecánico están disponibles comercialmente bajo el nombre de "Flexercell" (FlexCell International Corp.), mientras que algunos laboratorios utilizan costumbre-construido dispositivos. En este protocolo de vídeo se ha descrito la configuración y el uso de un dispositivo de este tipo en nuestro laboratorio.

La costumbre-construido "máquina de estirar" representado en este protocolo se ha utilizado en diversos estudios para investigar los efectos de la tensión cíclica uniaxial en diferentes tipos de células ^2,3. Esta máquina es un aparato versátil, con varios parámetros ajustables que se pueden utilizar para una variedad de estudios de la tensión mecánica. La configuración descritos en este documento representa un método único y robusto para la entrega de la tensión cíclica uniaxial de células adherentes en la cultura.