चूहे में मॉडलिंग स्ट्रोक - रेशा मॉडल के साथ मध्य प्रमस्तिष्क धमनी आड़

Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J. Vis. Exp. (47), e2423, doi:10.3791/2423 (2011).

उच्च गुणवत्ता और reproducibility की गारंटी करने के लिए, हम मानक संचालन प्रक्रिया (शराबी) के उपयोग की सलाह देते हैं. इस वीडियो में, प्रकाशित रूप में विकसित और हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता रियायतों लागू कर रहे ^हैं . 1

1. मध्य सेरेब्रल धमनी आड़

1. पशु चिकित्सा स्टाफ के साथ परामर्श में एक उपयुक्त संवेदनाहारी शासन के साथ चूहे anaesthetized हैं. (1.5 के साथ उदाहरण के प्रेरण - 2% Isoflurane रखरखाव और 1.0 के साथ - 2 / 3 N2O और 1 / 3 एक vaporizer का उपयोग O2 1.5 Isoflurane%).
   1. चूहों के शरीर का तापमान 36.5 पर डिग्री सेल्सियस 0.5 ± ° एक गर्म थाली के साथ सर्जरी के दौरान सी रखा है. एक प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग पैड, जो माउस के मलाशय के तापमान के अनुसार warms अत्यधिक की सिफारिश की है.
   2. कीटाणुरहित एक उपयुक्त एजेंट (जैसे 70% एथिल शराब) के साथ त्वचा और आसपास के फर और इसे बाद में शुष्क.
2. एक midline गर्दन चीरा बनाया है और कोमल ऊतकों के अलावा खींच रहे हैं.
3. बाईं आम मन्या धमनी (LCCA) सावधानी से आसपास के नसों (vagal तंत्रिका चोट के बिना) और एक संयुक्ताक्षर 6.0/7.0 स्ट्रिंग का उपयोग किया है से मुक्त dissected है. 5.0 स्ट्रिंग भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. बाईं बाह्य मन्या धमनी (LECA) तो अलग है और एक दूसरे गाँठ बनाया है.
5. अगले, बाईं आंतरिक मन्या धमनी (Lica) अलग है और एक गाँठ 6.0 फिलामेंट के साथ तैयार है.
6. बाईं आंतरिक मन्या धमनी (Lica) और बाएँ pterygopalatine धमनी (दीर्घावधि औसत) का अच्छा दृश्य प्राप्त करने के बाद, दोनों धमनियों काटा, एक microvascular क्लिप का उपयोग कर रहे हैं.
7. एक छोटा सा छेद LCCA में कटौती से पहले यह LECA और Lica bifurcates है. 8.0 सिलिकॉन hardener मिश्रण (नीचे देखें) के साथ लेपित नायलॉन का बना monofilament तो Lica में शुरू की है, जब तक यह क्लिप पर बंद हो जाता है है. ध्यान पश्चकपाल धमनी में प्रवेश नहीं करने के लिए भुगतान किया है. (चित्रा 1)
8. काटा धमनियों जबकि फिलामेंट Lica में डाला जाता है विलिस के चक्र में LMCA की उत्पत्ति रोक देना खोल रहे हैं.
9. Lica पर तीसरे गाँठ स्थिति में फिलामेंट ठीक करने के लिए बंद कर दिया है.
10. चूहों खारा 0.5 एमएल subcutaneously प्राप्त मात्रा पुनःपूर्ति के रूप में. दर्द से राहत के लिए, lidocaine जेल topically घाव में लागू किया जाता है.
11. यदि reperfusion की इरादा है, चूहों के 30 के लिए रहने - एक गर्म पिंजरे में 90 मिनट रोड़ा, घाव एक छोटे से सीवन क्लिप के साथ बंद हो सकता है. बाद में, एक दूसरे संज्ञाहरण प्रदर्शन किया है, आईसीए पर तीसरे गाँठ क्षणिक खोला और फिलामेंट वापस ले लिया है.
12. शेष sutures छोटा और त्वचा एक सर्जिकल सिवनी के साथ अनुकूलित है.
13. सभी जानवरों के रूप में ऊपर वर्णित एक दूसरा खंड पुनःपूर्ति प्राप्त करते हैं.
14. पशु दो घंटे के लिए एक गर्म पिंजरे में डाल रहे हैं शरीर के तापमान के लिए नियंत्रण.
    1. जानवरों असुविधा के संकेत के लिए सर्जरी के बाद दैनिक जाँच करना चाहिए. चूहों कुछ पोस्ट शल्य वजन घटाने दिखा सकता है. वे एक खा प्रोत्साहित करने के लिए फर्श पर रखा पेट्री डिश में मैश किए हुए भोजन प्राप्त करते हैं. भोजन दैनिक सात दिनों के लिए बदल दिया है.

2. शाम ऑपरेशन

1. नकली संचालन के लिए फिलामेंट LMCA रोक देना डाला जाता है और तुरंत वापस ले लिया करने के लिए त्वरित reperfusion (1.8) की अनुमति. एक दूसरे संज्ञाहरण सहित बाद आपरेशन मस्तिष्क ischaemia (1.14 1.9) के दौर से गुजर जानवरों पर प्रदर्शन करने के लिए समान है.

3. फिलामेंट की तैयारी

1. फिलामेंट के बाँझपन माना जाना चाहिए. निष्फल के रूप में अच्छी तरह के रूप में रेशा का एक उपयुक्त उपकरणों को संभालने का उपयोग बाद में एक बाँझ शल्य चिकित्सा के लिए एक शर्त है. फिलामेंट की कीटाणुशोधन मुश्किल है, के बाद से आम नसबंदी तरीकों के कई फिलामेंट की गुणवत्ता खराब हो सकता है. हालांकि विकिरण जैसे तरीकों, यूवी प्रकाश या γ रे, या रासायनिक बंध्याकरण के साथ उदाहरण के लिए, ethylene ऑक्साइड के रूप में उच्च प्रतिक्रियाशील गैसों के साथ उदाहरण के लिए, लागू कर रहे हैं.
2. 8.0 नायलॉन रेशा 11 मिमी की लंबाई में खुर्दबीन के नीचे काट रहा है
3. फिलामेंट टिप 8 मिमी की लंबाई से अधिक पूरी तरह से और समान रूप से से Xantopren एम mucosa और उत्प्रेरक NF Optosil hardener मिश्रण के साथ लेपित

4. प्रतिनिधि परिणाम

रक्त प्रवाह प्रतिबंध की अवधि पर निर्भर करता है, अलग मोटर और व्यवहार घाटे परिणाम. 30 और मस्तिष्क ischaemia के 60 मिनट, के बाद दोनों पार्श्व पुश करने के लिए ज्यादातर मामलों में पशुओं की कमी हुई प्रतिरोध दिखाने और हरकत में अशांति की वजह से चक्कर. सामने ली में एक flexor की स्थिति के रूप में मामूली घावों प्रकटएमबीएस. ये आसानी से प्रत्यक्ष संकेत आपरेशन की सफलता के लिए एक बुनियादी स्कोर के रूप में ^{इस्तेमाल} किया जा सकता है 2.

आकृति विज्ञान के घाव या तो ऊतक विज्ञान या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. साठ मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा मिनट ऊतक pannecrosis दोनों striatum और neocortex सहित एक क्षेत्र में उत्पादन, जबकि ischaemia के 30 मिनट के कारण मुख्य रूप से neuronal सेल मौत striatum करने के लिए सीमित रोधगलितांश मात्रा के संदर्भ ^में. 3 (चित्रा 2), हम उम्मीद एक मानक विचलन आपरेशनों के एक सेट में 30% से कम है. 60 मिनट के बाद 20% - मृत्युदर ischaemia और 10 के 30 मिनट के बाद 5% के आसपास के साथ रोड़ा समय पर निर्भर करता है.

एक अन्य न्यूनतम इनवेसिव संभावना आपरेशन है, जो अपनी सफलता का एक सीधा नियंत्रण की अनुमति देता है के दौरान लेजर डॉपलर flowmetry (एलडीएफ) का उपयोग है. एक व्यक्ति पशु में, 10 से कमी - 20% preocclusion मूल्यों की स्पष्ट रूप से फोकल मस्तिष्क ischemia के सफल प्रेरण इंगित करता है ⁴ हालांकि, एलडीएफ interindividual तुलना के लिए विधि के रूप में किया जा नहीं प्रयोग किया जाता कर सकते हैं, के बाद एलडीएफ केवल रक्त की मात्रात्मक परिवर्तन (प्रतिशत में) को मापने कर सकते हैं. एक छोटे और सीमित ऊतक नमूना मात्रा के भीतर प्रवाह. यह रक्त के प्रवाह में कमी के स्थानिक हद तक के बारे में जानकारी नहीं ^दे करता है 5.

वहाँ कई झटके के बाद व्यवहार पहलुओं का आकलन चाल ^{विश्लेषण 6,7,} 8 Rotarod, ^{ध्रुव} 9,10 परीक्षण, चिपकने वाला ^{हटाने} 11,12 परीक्षण, ^{सीढ़ी} 13,14 परीक्षण, सीढ़ी का ^डंडा 15,16 परीक्षण और मॉरिस पानी भूलभुलैया सहित परीक्षण कर रहे हैं ^17. इन सभी परीक्षणों में, MCAo के अधीन चूहों कम नियंत्रण जानवरों से सफलतापूर्वक करते हैं.

चित्रा 1 पोत वास्तुकला माउस में मस्तिष्क (पृष्ठभूमि में चित्रित) की आपूर्ति की योजना है. अलग अलग उपभेदों के बदलाव दिखा सकते हैं, उदाहरण के लिए पश्चकपाल धमनी कभी कभी आंतरिक मन्या धमनी से छोड़ देता है.

चित्रा 2 ठेठ घाव आकार के प्रॉक्सिमल MCAo मॉडल में reperfusion के विभिन्न समय अंक के बाद योजनाबद्ध चित्रण . बीच में, कार्यात्मक गतिविधि और MCAo के बाद मस्तिष्क रक्त के प्रवाह के विशिष्ट पाठ्यक्रम चित्रित कर रहे हैं. (MCAo मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा, एलडीएफ: लेजर डॉपलर प्रवाह माप)

क्षणिक, प्रॉक्सिमल एमसीए ^18,19 रोड़ा मॉडल यहाँ प्रस्तुत रोगियों में ischemic स्ट्रोक का सबसे आम प्रकार के एक ^mimics 20 चर reperfusion के समय के आधार पर, मॉडल क्षणिक ischemic हमले (TIA) से बड़े से लेकर क्षति के विभिन्न ग्रेड प्रदान करता है. ischemic गोलार्द्ध के प्रमुख भागों सहित दौरे. इस झटके के बाद शोधकर्ता अलग pathophysiological तंत्र का अध्ययन करने के ^लिए अनुमति देता है 20,21.

सर्जरी एक कम समय अवधि में किया जा सकता है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घावों का उत्पादन. फिर भी, इस confounders की एक पूरी तरह से नियंत्रण की आवश्यकता ^{आपरेशन} तकनीक में 22 छोटे मतभेदों. रोधगलितांश पर अलग प्रभाव के ^लिए खाते सकता है. 23,24 इसके अलावा, मस्तिष्क संवहनी शरीर रचना विज्ञान में प्रसरण के कारण, विभिन्न ^माउस उपभेदों एक अलग परिणाम 25,26 शारीरिक दिखा. तापमान स्नायविक नुकसान को प्रभावित करता ^है, हाइपोथर्मिया छोटे 27 घावों और अतिताप अधिक गंभीर घाटे के ^लिए अग्रणी के साथ 28 तदनुसार, तापमान नियंत्रण और रखरखाव के इस मॉडल में अत्यधिक प्रासंगिक ^है.. इसके अलावा 29, ब्लड प्रेशर और रक्त गैसों परिणाम की महत्वपूर्ण confounders के हैं और की जरूरत निरीक्षण किया जा रहा है. त्वरित और न्यूनतम इनवेसिव तरीकों का उपयोग ^30,31 (गैर इनवेसिव रक्तचाप माप, उपयुक्त और आसान पहुंच रक्त संग्रह साइटों) की सिफारिश की है. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के चुनाव भी अत्यधिक महत्वपूर्ण है, के रूप में कुछ neuroprotective प्रभाव है, और हो सकता है / या vasodilators हो, Isoflurane उदाहरण ^के लिए के रूप में 32 नतीजतन, संज्ञाहरण के लिए जोखिम के रूप में संभव है और मानकीकृत रूप में कम किया जाना चाहिए. हम जानवरों को जो अब से 15 मिनट के लिए सर्जरी आया है बाहर.

शल्य साइट शेविंग microabrasions और सूजन पैदा करता है और बाल टुकड़े विज्ञप्ति. यह आगे सूजन को बढ़ाने के लिए और स्थानीय संक्रमण है, जो स्ट्रोक pathophysiology पर प्रभाव हो सकता है को बढ़ावा हो सकता है. आवास की स्थिति, विशेष रूप से संवर्धन के उपयोग, स्ट्रोक परिणाम को प्रभावित और मानकीकृत और शोध रिपोर्ट में वर्णित किया ^जाना चाहिए सकता है 6,33,34 पर्यावरण संवर्धन और reproducibility पर उसके प्रभाव का उपयोग चर्चा ^का विषय है. 35 एक अन्य महत्वपूर्ण confounder ³⁶ ischaemia के अब समय के बाद विशेष रूप से स्ट्रोक संक्रमण के लिए प्रेरित किया जोखिम है, जो अतिरिक्त रुग्णता और वृद्धि की मृत्यु के ^लिए सुराग 37,38 के रूप में संक्रमण 5 करने के लिए 3 दिन के आसपास प्रतीक बन जाते हैं, यह इस तरह के मॉडल में लंबे अनुवर्ती अवधि के लिए महत्वपूर्ण परिणाम है.

परिणाम स्ट्रोक, मानकीकरण और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपन्यास उपचार कार्यनीतियों के विकास के लिए प्रासंगिक उत्पादन preclinical translational स्ट्रोक अनुसंधान ^में अत्यधिक महत्वपूर्ण 39 "अच्छी ^{प्रयोगशाला} अभ्यास" 40,41 जनादेश है.

1. प्रयुक्त जानवर की एक उपयुक्त और विस्तृत वर्णन;
2. नमूना आकार की गणना और उम्मीद प्रभाव आकार पर रिपोर्टिंग;
3. शामिल किए जाने और अपवर्जन मानदंड, इस अध्ययन से पहले स्थापित;
4. समूहों में आवंटन के randomization;
5. जांचकर्ताओं के लिए सम्मान के साथ आवंटन छिपाव;
6. विश्लेषण से बाहर रखा पशुओं रिपोर्टिंग;
7. परिणाम के अंधे मूल्यांकन;
8. ब्याज और अध्ययन के वित्तपोषण के संभावित संघर्ष रिपोर्टिंग.

जानवरों पर प्रयोगों Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, बर्लिन, जर्मनी द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

यह काम यूरोपीय समुदाय अनुदान समझौता n ° 201024 और n ° 202,213 (यूरोपीय स्ट्रोक नेटवर्क) के तहत सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. अतिरिक्त धन Bundesministerium फर Bildung und Forschung (स्ट्रोक अनुसंधान बर्लिन के लिए केंद्र), और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE) के द्वारा दिया गया था.

लेखकों एनीमेशन के उत्पादन के लिए समर्थन के लिए Mareike Thielke (प्रायोगिक तंत्रिका विज्ञान के लिए Dep., Charité बर्लिन) संचालन और Elke लुडविग (Charité वीडियो सेवाएँ) के दौरान धन्यवाद करना चाहते हैं.

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