Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J. Vis. Exp. (47), e2423, doi:10.3791/2423 (2011).

AVC está entre as causas mais freqüentes de morte e incapacidade de adultos, especialmente em países altamente desenvolvidos. No entanto, as opções de tratamento, até à data são muito limitados. Para atender a necessidade de novas abordagens terapêuticas, a pesquisa derrame experimental freqüentemente emprega modelos de roedores de isquemia cerebral focal. Maioria dos pesquisadores usa oclusão permanente ou transitória da artéria cerebral média (MCA) em camundongos ou ratos.

Oclusão proximal da artéria cerebral média (MCA), através da técnica do fio intraluminal (chamado de filamento ou modelo de sutura) é provavelmente o modelo mais utilizado em pesquisas curso experimental. O modelo MCAO intraluminal oferece a vantagem de induzir isquemia transitória ou permanente reprodutível do território da ACM de forma relativamente não-invasivo. Abordagens intraluminal interromper o fluxo de sangue de todo o território desta artéria. Filamento de oclusão proximal, portanto, prisões fluxo para as artérias lenticulo-estriado, que fornecem os gânglios basais. Filamento de oclusão dos resultados MCA em lesões reprodutível no córtex e estriado e pode ser permanente ou transitória. Em contraste, os modelos de indução distal (à ramificação das artérias lenticulo-estriado) MCA oclusão tipicamente poupar o striatum e envolvem principalmente o neocórtex. Além disso, estes modelos exigem craniotomia. No modelo demonstrado neste artigo, um filamento de silício revestido é introduzido na artéria carótida comum e avançado ao longo da artéria carótida interna no Círculo de Willis, onde bloqueia a origem da artéria cerebral média. Em pacientes, oclusão da artéria cerebral média estão entre as causas mais comuns de AVC isquêmico. Desde diferentes intervalos isquêmicos podem ser escolhidos livremente neste modelo, dependendo do ponto de tempo de reperfusão, as lesões de isquemia com diferentes graus de severidade podem ser produzidos. Reperfusão pela remoção do filamento oclusão pelo menos parcialmente modelos a restauração do fluxo sangüíneo após espontâneo ou terapêutico de lise (tPA) de um coágulo tromboembólicos em seres humanos.

Neste vídeo iremos apresentar a técnica básica, bem como as armadilhas e fatores de confusão que pode limitar o valor preditivo deste modelo.

Para garantir alta qualidade e reprodutibilidade, recomendamos a utilização de Procedimentos Operacionais Padrão (POP). Neste vídeo, SOPs publicado como desenvolvidos e utilizados em nosso laboratório são aplicadas ^1.

1. Oclusão da artéria cerebral média

1. Os ratos são anestesiados com um regime adequado anestésico em consultar com o pessoal veterinário. (Por exemplo, com a indução 1,5-2% isoflurano e manutenção com 1,0 - 1,5% do isoflurano em 03/02 N2O e 1 / 3 O2 usando um vaporizador).
   1. Temperatura corporal dos ratos é mantida a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante a cirurgia com uma placa de aquecimento. Um gabarito almofada de aquecimento controlado, que aquece de acordo com a temperatura retal do mouse, é altamente recomendado.
   2. Desinfectar a pele e pêlo ao redor com um agente apropriado (por exemplo, 70% de álcool etílico) e seque-o depois.
2. A incisão é feita na linha média do pescoço e os tecidos moles são separadas.
3. A artéria carótida comum esquerda (ACCE) é cuidadosamente dissecado livre de os nervos ao redor (sem prejudicar o nervo vago) e uma ligadura é feita através de 6.0/7.0 string. Cadeia de 5.0 também pode ser usado.
4. A artéria carótida externa (LECA) é separado e um segundo nó é feito.
5. Em seguida, a artéria carótida interna esquerda (ACIE) é isolado e um nó é preparado com um filamento 6.0.
6. Depois de obter boa visão da artéria carótida interna esquerda (ACIE) e da artéria pterigopalatina (LPA), ambas as artérias são cortadas, utilizando um clipe microvascular.
7. Um pequeno buraco é cortado na LCCA antes que ela se bifurca para o Leça e da ACIE. Um monofilamento feito de nylon revestido com 8,0 silício mistura endurecedor (veja abaixo) é então introduzida no ACIE, até que ele pára no clipe. Atenção tem de ser pago para não entrar na artéria occipital. (Figura 1)
8. As artérias cortadas são abertas enquanto o filamento é inserido no ACIE de ocluir a origem do TCE no círculo de Willis.
9. Terceiro nó na LICA está fechado para corrigir o filamento na posição.
10. Os ratos recebem 0,5 mL solução salina por via subcutânea, reposição de volume. Para alívio da dor, lidocaína gel é aplicada topicamente na ferida.
11. Se reperfusão destina-se, os ratos ficar por 30-90 min de oclusão em uma gaiola aquecida, a ferida pode ser fechada com um clipe de sutura de pequeno porte. Depois, uma segunda anestesia é realizada, o terceiro nó na ICA é momentânea e abriu o filamento retirada.
12. As suturas restantes são encurtados ea pele é adaptada com uma sutura cirúrgica.
13. Todos os animais recebem uma reposição segundo volume como descrito acima.
14. Animais são colocados em uma gaiola aquecida por duas horas para controlar a temperatura do corpo.
    1. Os animais devem ser verificadas diariamente após a cirurgia para sinais de desconforto. Os camundongos puderam mostrar alguma perda de peso pós-cirúrgico. Eles recebem comida amassada em uma placa de Petri, colocado no chão para promover a alimentação. A comida é substituída por dia durante sete dias.

2. Sham Operação

1. Para operações de farsa o filamento é inserida para ocluir TCE e retirados imediatamente para permitir reperfusão instantâneas (1,8). A operação subseqüente é idêntico ao que realizou sobre os animais submetidos a isquemia cerebral (1,9-1,14), incluindo uma anestesia segundo.

3. Preparação do Filamento

1. Esterilidade do filamento deve ser considerada. O uso de equipamentos esterilizados, bem como um manejo adequado do filamento depois é um pré-requisito para uma cirurgia estéril. Desinfecção do filamento é difícil, pois muitos dos métodos de esterilização comum pode piorar a qualidade do filamento. No entanto métodos tais como a radiação, por exemplo, com a luz UV ou raios γ, ou esterilização química, por exemplo, com gases altamente reativos, como óxido de etileno, são aplicáveis.
2. 8,0 filamento de nylon é cortado em pedaços de 11 milímetros sob o microscópio
3. A ponta filamento deve ser revestida completamente e uniformemente ao longo de um comprimento de 8 mm com uma mistura de endurecedor Xantopren M Mucosa e NF Activator Optosil

4. Resultados representante

Dependendo da duração da restrição do fluxo sanguíneo, motor diferente e resultado déficits comportamentais. Ambos após 30 e 60 min de isquemia cerebral, animais na maioria dos casos apresentam resistência diminuiu para empurrar lateral e circulando devido a perturbações na locomoção. Milder manifestar lesões como uma posição flexor na frente limbs. Estes sinais facilmente observável pode ser usado como uma pontuação básica para o sucesso da operação. ²

Morfologicamente a lesão pode ser avaliada usando histologia ou Ressonância Magnética (MRI). Sessenta minutos de oclusão da artéria cerebral média produz pannecrosis tecido em uma área, incluindo tanto o striatum eo neocórtex, enquanto 30 minutos de isquemia causar a morte celular neuronal principalmente limitada para o estriado. ³ (Figura 2) Em termos de volume de infarto, esperamos um desvio padrão inferior a 30% em um conjunto de operações. Mortalidade depende do tempo de oclusão com cerca de 5% após 30 min de isquemia e 10 - 20% após 60 min.

Outra possibilidade minimamente invasivo, é o uso de Laser Doppler fluxometria (FDL) durante a operação, o que permite um controle direto de seu sucesso. Em um animal individual, redução de 10-20% dos valores preocclusion indica claramente a indução bem-sucedida de isquemia cerebral focal ^{4 No} entanto, LDF não pode ser usada como um método para comparações interindividuais, pois LDF só pode medir mudanças quantitativas (em percentagem) de sangue. fluxo dentro de um volume pequeno e limitado o tecido da amostra. Não dá informações sobre a extensão espacial da redução do fluxo de sangue. ⁵

Existem vários testes para avaliar aspectos comportamentais após um AVC, incluindo análise da marcha ^6,7, Rotarod ^8, teste Pólo ^9,10, teste de remoção de adesivo ^11,12, teste escadaria ^13,14, teste escada degrau ^15,16 e labirinto aquático de Morris ^17. Em todos esses testes, os ratos submetidos a MCAo executar menos sucesso do que os animais controle.

Figura 1. Esquema da arquitetura do navio que irrigam o cérebro (retratado no fundo) no mouse. Cepas diferentes podem apresentar variações, por exemplo a artéria occipital, por vezes, sai da artéria carótida interna.

Figura 2. Ilustração esquemática de tamanhos de lesão típica depois de momentos diferentes de reperfusão no modelo MCAo proximal. No meio, o curso típico da atividade funcional e do fluxo sanguíneo cerebral após MCAo são retratados. (MCAo: cerebral média de oclusão da artéria, LDF: Laser medição de fluxo Doppler)

O modelo de transitória, MCA proximal da oclusão ^18,19 apresentadas aqui imita um dos tipos mais comuns de AVC isquêmico em pacientes. Baseado em ²⁰ vezes reperfusão variável, o modelo oferece diferentes graus de danos que variam de ataque isquêmico transitório (TIA) para grandes infartos, incluindo grandes partes do hemisfério isquêmica. Isso permite que o pesquisador a estudar mecanismos fisiopatológicos diferentes após o AVC. ^20,21

Cirurgia pode ser realizada em um curto período de tempo e produz lesões altamente reprodutível. No entanto, isto requer um rigoroso controle de fatores de confusão. ²² pequenas diferenças na técnica de operação podem ser responsáveis ​​por efeitos diferentes sobre o infarto. ^23,24 Além disso, devido a variações na anatomia vascular cerebral, diferentes linhagens de camundongos mostram um resultado diferente. ^25,26 Corpo a temperatura afeta a danos neurológicos, com hipotermia levando a lesões menores ²⁷ e hipertermia para mais graves déficits. ²⁸ Por conseguinte controle de temperatura, e manutenção é altamente relevante neste modelo. ²⁹ Além disso, a pressão arterial e gases sanguíneos são importantes fatores de confusão de resultados ea necessidade de ser monitorado. ^30,31 O uso de métodos rápidos e mínima invasiva (não-invasivo de medição da pressão arterial, adequado e fácil locais de recolha acessível sangue) é recomendada. A escolha do anestésico também é altamente importante, pois alguns podem ter efeitos neuroprotetores e / ou ser vasodilatadores, como por exemplo isoflurano. ^{32 Por} conseguinte, a exposição a anestesia deve ser tão curto quanto possível e padronizados. Excluímos animais que se submeteram à cirurgia por mais de 15 min.

Raspar o sítio cirúrgico produz microabrasions e inflamação e libera fragmentos de cabelo. Isto pode aumentar ainda mais a inflamação e promover a infecção local, que possa ter impacto na fisiopatologia acidente vascular cerebral. Condições de habitação, especialmente o uso de enriquecimento, pode afetar o resultado acidente vascular cerebral e deve ser padronizada e descrita em relatórios de pesquisa. ^6,33,34 O uso de enriquecimento ambiental e seus efeitos sobre a reprodutibilidade é uma questão de discussão. Confundidor ³⁵ Outra importante é a risco para a infecção induzida por acidente vascular cerebral, especialmente depois de tempos mais longos de isquemia ^36, o que leva a morbidade adicional e aumento da mortalidade. ^37,38 Como as infecções tornam-se sintomáticas em torno de 3 a 5 dias, isto tem consequências importantes para o longo prazo de acompanhamento em tais modelos.

Para produzir resultados relevantes para o desenvolvimento de estratégias de tratamento da novela para a normalização acidente vascular cerebral e controle de qualidade é muito importante na investigação translacional pré-golpe ³⁹ "Boas Práticas de Laboratório" ^40,41 mandatos.:

1. uma descrição adequada e pormenorizada dos animais utilizados;
2. cálculo amostral e informação sobre o tamanho do efeito esperado;
3. critérios de inclusão e exclusão, criada antes do estudo;
4. randomização da alocação em grupos;
5. ocultação da alocação no que diz respeito aos investigadores;
6. relatórios animais excluídos da análise;
7. avaliação cega dos resultados;
8. relatórios potenciais conflitos de interesse e de financiamento do estudo.

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlim, Alemanha.

Este trabalho foi financiado pelo Programa da Comunidade Europeia Quadro (FP7/2007-2013), sob subvenção n ° 201024 e n ° 202213 (Network Curso Europeu). Financiamento adicional foi dada pelo für Bildung und Forschung Bundesministerium (Centro de Pesquisa para o curso de Berlim), ea Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE).

Os autores gostariam de agradecer a Mareike Thielke (Dep. de Neurologia Experimental, Charité de Berlim), pelo apoio durante a operação e Ludwig Elke (Serviços de Vídeo Charité) para produzir a animação.

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