Fare Modelleme İnme - Filament Model Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J. Vis. Exp. (47), e2423, doi:10.3791/2423 (2011).

İnme, ölüm ve yetişkin sakatlık, özellikle çok gelişmiş ülkelerde en sık rastlanan nedenleri arasında yer almaktadır. Ancak, bugüne kadar tedavi seçenekleri çok sınırlı. Yeni terapötik yaklaşımlara ihtiyacı karşılamak için, deneysel inme araştırma, sık sık fokal serebral iskemi kemirgen modelleri kullanmaktadır. Çoğu araştırmacılar, fareler ya da sıçanlar orta serebral arter (MCA) kalıcı veya geçici oklüzyon kullanın.

Intraluminal sütür tekniği (Filament veya dikiş modeli olarak da adlandırılır) ile orta serebral arter (MCA) proksimal oklüzyon muhtemelen deneysel inme araştırmalarında en sık kullanılan model. Intraluminal MCAO model nispeten non-invaziv bir şekilde MCA topraklarının tekrarlanabilir geçici veya kalıcı iskemi inducing avantajı sunmaktadır. Intraluminal yaklaşımlar tüm topraklarının bu arter kan akışını keser. Filament oklüzyon böylece tutuklamalar, bazal ganglia kaynağı lenticulo-yivler arterler, proksimal akışı. Filament tekrarlanabilir lezyonlar korteks ve striatum MCA sonuçları tıkanıklığı ve kalıcı veya geçici olabilir. Buna karşılık, distal inducing modelleri (lenticulo yivler arterlerin dallanma) MCA oklüzyonu tipik striatum ve yedek neokorteks öncelikle dahil. Buna ek olarak bu modellerin kraniektomi gerektirir. Bu makale gösterilen model, bir silikon kaplı filament karotis artere tanıtıldı ve orta serebral arter kökenli bloklar Willis, Çember içine iç karotis arteri boyunca gelişmiş. Hastalarda, orta serebral arter oklüzyonlar iskemik inme en sık görülen nedenleri arasında yer almaktadır. Reperfüzyon sırasında noktası bağlı olarak iskemik lezyonların şiddeti değişen derecelerde olabilir, bu modelde değişik iskemik aralıklarla serbestçe seçilmiş olabilir bu yana. Kan akışının kısmen tromboembolik insanlarda pıhtı kendiliğinden veya tedavi (tPA) Parçalama işleminden sonra restorasyon modelleri en azından kapatılmasıy filament kaldırılması Reperfüzyon.

Bu video temel tekniğinin yanı sıra, bu modelin prediktif değeri sınırı en büyük tuzaklar ve karışıklıklar sunacak.

Yüksek kaliteli ve tekrarlanabilirlik garanti etmek için, Standart Çalışma Prosedürleri (SOP) kullanmanızı tavsiye ederiz. Bu video, laboratuvarda özel olarak geliştirilen ve kullanılan yayınlanan SOP ^uygulanır . 1

1. Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

1. Fareler, veteriner personel ile istişarede uygun bir anestezi rejimi ile anestezi . (Örnek: indüksiyon 1.5 - 1.0 ile% 2 İsofluranın ve bakım - 2 / 3 N2O ve bir buharlaştırıcı kullanarak 1 / 3 O2 İsofluranın% 1.5).
   1. Farelerin Vücut sıcaklığı 36,5 ° C ± 0.5 ° C ısıtma plakası ile ameliyat sırasında korunur. Fare rektal sıcaklık göre ısıtan bir geri besleme kontrollü bir ısıtma yastığı, şiddetle tavsiye edilir.
   2. Deri ve kürk çevredeki uygun bir ajan (örneğin% 70 etil alkol) ile dezenfekte edin ve daha sonra kurulayın.
2. Bir orta hat boyun insizyonu yapılır ve yumuşak dokuların dışında çekti.
3. Sol karotis arter (LCCA) dikkatle çevresindeki sinirler (vagus siniri zarar vermeden) ve ligatür 6.0/7.0 dize kullanılarak yapılır disseke edilir. 5.0 dize de kullanılabilir.
4. Sol eksternal karotis arter (Leça) sonra ayrılır ve ikinci bir düğüm yapılır.
5. Sonra, sol internal karotid arter (Lica) izole edilir ve bir düğüm bir filament 6.0 ile hazırlanmıştır.
6. Sol internal karotid arter (Lica) ve sol pterigopalatin arter (LPA) iyi bir görüş aldıktan sonra, hem de arterlerde mikrovasküler klip kullanarak kırpılır.
7. Leca ve Lica çatallanmasıdır önce küçük bir delik LCCA kesilir. Silikon sertleştirici karışımı (aşağıya bakınız) ile kaplı 8.0 naylondan yapılmış bir monofilament klibi durana kadar sonra, Lica tanıtıldı. Dikkat oksipital arter girmek için ödenecek. (Şekil 1)
8. Filament Willis daire LMCA kökeni kapamak için Lica takılı iken kırpılır arterler açıldı.
9. Lica üçüncü düğüm filament konumunu düzeltmek için kapalıdır.
10. Fareler hacim ikmal olarak subkutan 0,5 mL salin alırsınız. Ağrı kesici, Lidokain jel topikal yara uygulanır.
11. Reperfüzyon amaçlanan ise, fareler için 30 kalır ısıtılmış bir kafes içinde 90 dakika oklüzyon, yara küçük bir dikiş klip ile kapalı olabilir. Daha sonra, ikinci bir anestezi yapılır, ICA üçüncü düğüm anlık açılan ve filament geri.
12. Kalan dikişler kısaltılmış ve deri cerrahi sütür ile uyarlanmıştır.
13. Tüm hayvanlar, yukarıda açıklandığı gibi ikinci bir birim ikmal alırsınız.
14. Hayvanlar vücut ısısını kontrol etmek için iki saat boyunca ısıtmalı bir kafese konur.
    1. Hayvanların rahatsızlık belirtileri için ameliyat sonrası günlük olarak kontrol edilmelidir. Fareler bazı cerrahi sonrası kilo kaybı gösterebilir. Onlar yeme teşvik etmek için zemin üzerine yerleştirilen bir petri-çanak püresi gıda alırsınız. Yemek yedi gün boyunca günlük olarak değiştirilir.

2. Åžam Operasyonu

1. Sahte işlemler için filament LMCA kapamak için yerleştirilir ve anında reperfüzyon (1.8) izin hemen geri çekilir. Ikinci bir anestezi de dahil olmak üzere daha sonraki çalışma serebral iskemi (1.14 1.9) gören hayvanlar üzerinde yapılan aynıdır.

3. Filament hazırlanması

1. Filament Sterilite düşünülmelidir. Sterilize filament yanı sıra, uygun bir işleme ekipman kullanımı daha sonra steril bir cerrahi için bir ön koşuldur. Filament Dezenfeksiyon, zor, birçok ortak sterilizasyon yöntemleri filament kalite kötüleştirebilir. Ancak, radyasyon gibi yöntemlerle, UV ışık veya γ ışınları, veya kimyasal sterilizasyon örneğin, örneğin, etilen oksit gibi yüksek reaktif gazlar ile uygulanabilir.
2. 8.0 naylon filament mikroskop altında 11 mm uzunluğa bölünür
3. Filament ucu Xantopren M Mukoza ve aktivatör NF Optosil sertleştirici karışımı ile 8 mm uzunluğu boyunca tamamen ve eşit şekilde kaplanmış olmalıdır

4. Temsilcisi Sonuçlar

Kan akımı kısıtlaması süresine baÄŸlı olarak, farklı motor ve davranışsal açıkları sonucu,. Her ikisi de 30 ve 60 dk serebral iskemi, sonra hayvanların çoÄŸu durumda yanal itme azalmış direnç göstermek ve hareketlilik içinde rahatsızlık nedeniyle çizerek. Daha hafif lezyonlar ön li bir fleksör pozisyon olarak tezahürmbs. Bu kolayca gözlemlenebilir iÅŸaretler operasyonun baÅŸarısı için temel bir puan olarak kullanılabilir. ²

Morfolojik lezyon histoloji veya Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) kullanılarak deÄŸerlendirilebilir. Orta serebral arter tıkanıklığı Altmış dakika, 30 dakika iskemi striatum sınırlı esas nöronal hücre ölümüne neden ise doku pannecrosis striatum ve neokorteks de dahil olmak üzere bir alan üretir. ³ (Åžekil 2) infarkt hacmi açısından, biz bekliyoruz bir standart sapma bir dizi operasyon% 30 daha düşüktür. 60 dakika sonra% 20 - Ölüm 30 iskemi ve 10 dakika sonra yaklaşık% 5 ile kapama süresi baÄŸlıdır.

DiÄŸer minimal invaziv olasılık baÅŸarısını doÄŸrudan bir kontrolü saÄŸlayan iÅŸlem sırasında lazer Doppler flowmetre (LDF) kullanımı. Bir bireysel hayvan, 10 azalma - preocclusion deÄŸerleri% 20 fokal serebral iskemi baÅŸarılı indüksiyon açıkça gösterir ⁴ Ancak, LDF kiÅŸiler arası karşılaÅŸtırmalar yöntemi olarak kullanılır olması deÄŸil., LDF sadece kan nicel deÄŸiÅŸiklikler (yüzde olarak) ölçmek. Beri. küçük ve sınırlı bir doku örneÄŸi hacmi içinde akar. Bu kan akımını azaltma mekansal boyutları hakkında bilgi vermez. ⁵

Yürüme analizi ^6,7, Rotarod ^8, kutup testi ^9,10, yapışkan kaldırma testi ^11,12, merdiven testi ^{13,14, 15,16} merdiven basamak testi ve Morris su labirenti de dahil olmak üzere, inme sonrası davranışsal yönlerini değerlendirmek için çeşitli testler vardır ^17. Tüm bu testler, MCAo için maruz kalan farelerde kontrol hayvanlarına göre daha az başarılı bir şekilde gerçekleştirin.

Şekil 1 fare beyin (arka plan tasvir) besleyen damar mimari Programı. Farklı suşlar değişkenlik gösterir, örneğin oksipital arter bazen internal karotid arter bırakır.

Şekil 2. Tipik lezyon boyutları proksimal MCAo modelinde reperfüzyon farklı bir zaman geçtikten sonra şematik gösterimi. Ortasında, fonksiyonel aktivite ve MCAo sonra serebral kan akımı tipik seyri tasvir edilmektedir. (MCAo: Orta serebral arter tıkanıklığı, LDF: Lazer Doppler akım ölçümü)

Geçici, proksimal MCA oklüzyonu ^18,19 modeli hastalarda iskemik inme en yaygın türlerinden biri taklit sundu. DeÄŸiÅŸken reperfüzyon kez ²⁰ modeli büyük geçici iskemik atak (TIA) kadar hasar farklı sınıflarda iskemik yarımkürenin büyük parçalar da dahil olmak üzere infarktlar. Bu vuruÅŸ sonra araÅŸtırmacı farklı patofizyolojik mekanizmalar çalışma saÄŸlar. ^20,21

Cerrahi kısa bir süre içinde gerçekleÅŸtirilir ve yüksek tekrarlanabilir lezyonlar olabilir. Bununla birlikte, bu karışıklıklar tam bir kontrolü gerektirir. Operasyon tekniÄŸi ²² küçük farklılıklar infarkt farklı etkileri hesaba olabilir. ^23,24 Ayrıca, serebral vasküler anatomi sapmaların nedeniyle, farklı fare suÅŸları farklı bir sonuç göstermektedir. ^25,26 Vücut sıcaklık, nörolojik hasar hipotermi daha ciddi eksiklikler küçük lezyonların ²⁷ ve hipertermi önde gelen etkiler. Buna göre ^28, sıcaklık kontrolü ve bakımı, bu modelde son derece alakalı. Buna ek olarak, kan basıncı ve kan ^gazları 29 sonuç önemli karışıklıklar ve izlenecektir. ^30,31 hızlı ve minimal invaziv yöntemler kullanmak (non-invaziv uygun kan basıncı ölçümü ve kolay eriÅŸilebilir bir kan toplama sitelerine) tavsiye edilir. Anestezik seçim Ä°sofluranın örneÄŸin bazı nöroprotektif etkileri ve / veya vazodilatörler olması gibi, aynı zamanda son derece önemlidir. Sonuç olarak ^32, anestezi maruz kalma, mümkün ve standart olarak kısa olmalıdır . 15 dakika daha uzun ameliyatı geçirmiÅŸ hayvanlar dahil deÄŸildir.

Cerrahi sitesi TıraÅŸ microabrasions ve inflamasyon üretir ve saç parçaları bültenleri. Bu da iltihabı artırabilir ve lokal enfeksiyon, inme patofizyolojisinde etkisi olabilir teÅŸvik olabilir. Konut koÅŸulları, özellikle zenginleÅŸtirme kullanımı, inme sonucu etkileyebilir ve standardize edilmiÅŸ ve araÅŸtırma raporları açıklanan olmalıdır. ^6,33,34 tekrarlanabilirlik çevresel zenginleÅŸtirme ve etkisi kullanılması tartışma konusudur. ³⁵ Bir baÅŸka önemli karıştırıcı özellikle iskemi ⁽³⁶⁾ uzun zamanlar sonra enfeksiyon indüklenen inme riski, hangi ek morbidite ve artmış mortalite açar. ^37,38 enfeksiyonları 5 gün yaklaşık 3 semptomatik hale geldikçe, bu tür modeller takip uzun vadeli önemli sonuçları vardır.

Inme, standardizasyon ve kalite kontrolü için yeni tedavi stratejilerinin geliÅŸtirilmesi için ilgili üretmek için preklinik translasyonel inme araÅŸtırmalarında son derece önemlidir ³⁹ "Ä°yi Laboratuar Uygulamaları" ^40,41 zorunlu kılmaktadır.

1. kullanılan hayvanların uygun ve detaylı bir tanımı;
2. örneklem büyüklüğü beklenen etki büyüklüğü hesaplanması ve raporlanması;
3. içerme ve dışlama kriterleri, çalışma öncesi;
4. gruplar halinde tahsisi randomizasyon;
5. araştırmacılara göre dağılımı gizlenmesi;
6. analizin dışında hayvanların raporlama;
7. sonucu kör değerlendirmesi;
8. ilgi ve çalışma fonları potansiyel çatışmalar raporlama.

Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Almanya tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Bu çalışma hibe anlaşması n ° 201.024 ve n ° 202.213 (Avrupa İnme Network) kapsamında Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) tarafından finanse edildi. Ek finansman Bundesministerium für Bildung und Forschung (Stroke Araştırma Berlin Merkezi) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE) tarafından verildi.

Yazarlar animasyon üretmek için çalışma ve Elke Ludwig (Charité Video Servisleri) Mareike Thielke (Deneysel Nöroloji Dep., Charite Berlin) sırasında destek için teşekkür etmek istiyorum.

1. Dirnagl, U. & Members of the MCAO-SOP Group, Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings (Available online <http://precedings.nature.com/documents/3492/version/2>) (2010).
2. Bederson, J.B. et al., Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke 17 (3), 472-476 (1986).
3. Katchanov, J. et al., Selective neuronal vulnerability following mild focal brain ischemia in the mouse. Brain Pathol 13 (4), 452-464 (2003).
4. Dirnagl, U., Complexities, Confounders, and Challenges in Experimental Stroke Research: A checklist for researchers and reviewers in Rodent models of stroke, edited by U. Dirnagl (Springer, New York Dordrecht Heidelberg London, 2010), pp. 267.
5. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., & Pulsinelli, W., Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab 9 (5), 589-596 (1989).
6. Wang, Y. et al., A comprehensive analysis of gait impairment after experimental stroke and the therapeutic effect of environmental enrichment in rats. J Cereb Blood Flow Metab 28 (12), 1936-1950 (2008).
7. Lubjuhn, J. et al., Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods 184 (1), 95-103 (2009).
8. Jones, B.J. & Roberts, D.J., The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol 20 (4), 302-304 (1968).
9. Matsuura, K., Kabuto, H., Makino, H., & Ogawa, N., Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. J Neurosci Methods 73 (1), 45-48 (1997).
10. Bouet, V. et al., Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol 203 (2), 555-567 (2007).
11. Freret, T. et al., Delayed administration of deferoxamine reduces brain damage and promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in the rat. Eur J Neurosci 23 (7), 1757-1765 (2006).
12. Modo, M. et al., Neurological sequelae and long-term behavioural assessment of rats with transient middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods 104 (1), 99-109 (2000).
13. Montoya, C.P., Campbell-Hope, L.J., Pemberton, K.D., & Dunnett, S.B., The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods 36 (2-3), 219-228 (1991).
14. Baird, A.L., Meldrum, A., & Dunnett, S.B., The staircase test of skilled reaching in mice. Brain Res Bull 54 (2), 243-250 (2001).
15. Metz, G.A. & Whishaw, I.Q., Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. J Neurosci Methods 115 (2), 169-179 (2002).
16. Farr, T.D., Liu, L., Colwell, K.L., Whishaw, I.Q., & Metz, G.A., Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. J Neurosci Methods 153 (1), 104-113 (2006).
17. Morris, R., Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods 11 (1), 47-60 (1984).
18. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., & Ooneda, G., Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke 8, 1 - 8 (1986).
19. Longa, E.Z., Weinstein, P.R., Carlson, S., & Cummins, R., Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20 (1), 84-91 (1989).
20. Endres, M. & Dirnagl, U., Neuroprotective Strategies in Animal and in vitro-Models of Neuronal Damage: Ischemia and Stroke in Molecular and Cellular Biology of Neuroprotection in the CNS, edited by Christian Alzheimer (Kluver Academic and Landes Bioscience, New York, 2003), Vol. 513, pp. 455 - 474.
21. Dirnagl, U., Iadecola, C., & Moskowitz, M.A., Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 22 (9), 391-397 (1999).
22. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B.P., Campbell, K., & Winn, H.R., Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J Exp Stroke Transl Med 2 (2), 2-27 (2009).
23. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., & Saito, N., Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods 174 (1), 18-24 (2008).
24. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S.S., & Weinstein, P.R., Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res 970 (1-2), 131-139 (2003).
25. Beckmann, N., High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med 44 (2), 252-258 (2000).
26. Barone, F.C., Knudsen, D.J., Nelson, A.H., Feuerstein, G.Z., & Willette, R.N., Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab 13 (4), 683-692 (1993).
27. Florian, B. et al., Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett 438 (2), 180-185 (2008).
28. Noor, R., Wang, C.X., & Shuaib, A., Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett 349 (2), 130-132 (2003).
29. Barber, P.A., Hoyte, L., Colbourne, F., & Buchan, A.M., Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke 35 (7), 1720-1725 (2004).
30. Shin, H.K. et al., Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke 39 (5), 1548-1555 (2008).
31. Bottiger, B.W. et al., Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res 65 (2), 135-142 (1999).
32. Kapinya, K.J., Prass, K., & Dirnagl, U., Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport 13 (11), 1431-1435 (2002).
33. Endres, M. et al., Mechanisms of stroke protection by physical activity. Ann Neurol 54 (5), 582-590 (2003).
34. Gertz, K. et al., Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res 99 (10), 1132-1140 (2006).
35. Richter, S.H., Garner, J.P., & Wurbel, H., Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods 6 (4), 257-261 (2009).
36. Liesz, A. et al., The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia: immunodepression versus immunomodulation. Stroke 40 (8), 2849-2858 (2009).
37. Meisel, C., Schwab, J.M., Prass, K., Meisel, A., & Dirnagl, U., Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci 6 (10), 775-786 (2005).
38. Engel, O. & Meisel, A., Models of Infection Before and After Stroke: Investigating New Targets. Infect Disord Drug Targets 9 (5) (2010).
39. Dirnagl, U., Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab 26 (12), 1465-1478 (2006).
40. Macleod, M.R. et al., Good laboratory practice: preventing introduction of bias at the bench. Stroke 40 (3), e50-52 (2009).
41. STAIR Group, Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development. Stroke 30 (12), 2752-2758 (1999).

7 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.