Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas

1. Preparação do Reagente

1. A solução de relaxamento e de preservação (RP Solution) é preparada como descrito anteriormente, com pequenas modificações ^1. Resumidamente, a solução consiste em RP 2.77mM CAK EGTA _2, K ₂ 7.23mM EGTA, imidazol 20mM, ditiotreitol 0,5 mM, taurina 20mM, 50mM K-MES, 6,56 MgCl _2, 5,7 ATP, fosfocreatina 14.3mm, pH 7,1, ajustado à temperatura ambiente (RT). Filtrar a solução através de um filtro 0,45 mM para esterilizar. Divida em 15 porções mL (tubos Falcon de polipropileno) e armazenar a -20 ° C Veja a discussão para as receitas.
2. A Solução respirometria mitocondrial (MiR05) é preparado como descrito anteriormente ² e contém 0,5 mM EGTA, MgCl 3mM ₂ .6 H ₂ O, taurina 20mM, 10mM KH ₂ PO _4, HEPES 20mM, 1g / L BSA, 60mm de potássio lactobionato, 110mm pH de sacarose, 7,1, ajustado a 30 ° C. Filtrar a solução através de um filtro 0,45 mM para esterilizar. Divida em 50 porções mL (tubos Falcon de polipropileno) e armazenar a -20 ° C. Veja a discussão para as receitas. O fator de solubilidade do oxigênio para MiR05 a 30 ° C e 37 ° C é de 0,92 ^3.

2. Preparação dos tecidos

A. Cardiac fibras preparação mecânica

1. Procedimentos foram aprovados pela Universidade de Calgary e Animal Care Use Comitê e respeitar a Associação Canadense de orientações Laboratory Animal Science for experimentação.
2. Deslocamento cervical para imobilizar o rato é o método preferido. Alternativamente, intraperotineal injeção (IP) de ketamina e xilazina (80 e 10mg/kg, respectivamente) ou 0,5 mg de pentobarbital sódico pode ser administrado. Nota: pentobarbital sódico é um inibidor reversível da NADH desidrogenase (complexo I) ^4.
3. Remover o coração e colocá-lo em uma placa de Petri contendo a solução de RP no gelo (Figura 1A). Remova cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo e / ou gordura usando um microscópio de dissecação.
4. Cortar o coração pela metade ao longo do septo. Excise peso de 10-25mg molhado (ww) de tecido, cortando a partir da superfície do endocárdio do ventrículo esquerdo (Figura 1B). Garantir a incisão é ao longo da orientação das fibras para minimizar os danos mecânicos ao miocárdio.
5. Coloque o dissecados subamostra, de tecido em um prato separado petri contendo a solução de RP no gelo. Usando um microscópio de dissecção cortar o coração em tiras longitudinal ao longo de orientação das fibras com um diâmetro de 1-1.5mm.
6. Encurtar as tiras com um bisturi para comprimentos de 2-4mm (Figura 1C).
7. Extremo cuidado e usando uma pinça afiada feixes de fibras mecanicamente separada. Feixes de fibras final deve conter um máximo de 6-8 fibras, ligados por pequenas áreas de contato, pesando não mais que 5mg ww. Fibras cardíacas de 1-3mg ww são recomendados. Visualmente, o tecido cardíaco deve mudar de vermelho original para uma coloração rosa pálido (Figura 1D).

B. Cardiac fibra preparação química feixes

1. Colocar uma placa de 12 bem no gelo.
2. Enxágüe bem o (s) com RP solução para minimizar a contaminação de cálcio ^5.
3. Transferir os feixes de fibras mecanicamente preparados para um poço contendo 3mL solução RP gelada com 50ug / mL saponina. Nota: A concentração de saponina não depende da quantidade de músculo cardíaco presente na solução.
4. Incubar por 20 minutos com agitação leve no gelo.

C. Cardiac lavar Bundle Fiber

1. Enxágüe com um novo poço MiR05 para minimizar a contaminação de cálcio ^5.
2. Transferir os pacotes cardíaca para o novo poço contendo 10 ml gelada MiR05. Incubar por 10 minutos com agitação leve no gelo.
3. Repita (1-2) 2-3 vezes com MiR05 fresco. Os passos de lavagem repetitivos são para garantir a remoção ou saponina, ATP, ADP e qualquer substratos remanescentes de feixes de fibras.

D. determinação do peso úmido

1. Diretamente antes da análise respiratória, peso úmido é obtido pela blotting os feixes de fibras individuais (1-3mg ww) sobre uma superfície absorvente (papel filtro) usando uma pinça e segurando a fibra para a superfície para 5s ou até que toda a umidade é mau de distância.
2. Usando uma outra superfície absorvente, remova o excesso de líquido do fórceps.
3. Tara a escala e coloque o feixe de fibras em um plástico pesam barco para medição de massa.
4. Transferir o feixe de fibras cardíacas de um novo poço com gelado MiR05. O feixe de fibras está pronto para a avaliação de consumo de oxigênio.

3. Análise OXPHOS respirométrico

A. Equipamentos respirométricos

1. O laboratório utiliza e recomenda uma de duas câmaras oxygraph titulação de injeção (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). O Oxygraph 2-k oferece respirometria de alta resolução em grande parte pela utilização de hardware e software instrumental (DatLab) que minimiza o fundo instrumental que contribuem paraconsumo de artefatos de oxigênio.
2. Calibração do oxygraph é um passo essencial para minimizar os efeitos de confusão de consumo de oxigênio instrumental. Calibração varia ligeiramente, dependendo da oxygraph. Consulte o manual do usuário oxygraph para procedimentos específicos.

B. Qualidade Representante Protocolo de Validação de Controle / Técnica

1. Garantir MiR05 foi adicionado ao oxygraph habitação câmaras os sensores de oxigênio polarográfico (POS) e dar o tempo adequado para a saturação do ar e equilíbrio do MiR05 a 37 ° C antes de colocar as fibras cardíacas murino para as câmaras oxygraph.
2. As amostras das fibras cardíacas são colocados na MiR05 agitado das câmaras oxygraph. Nota: Certifique-se de agitar as barras são PVDF ou PEEK revestido bares agitador (6mm diâmetro).
3. Usando uma seringa cheia de oxigênio, aumentar a concentração de oxigênio das câmaras oxygraph a 250-550uM. Note-se que a concentração de oxigênio é limitante para a preparação de fibras permeabilizadas em até 50% acima de saturação do ar ^6. Permitir 5-10min para a estabilização de concentração de oxigênio.
4. Usando um micro-Hamilton 25μL, 10μL de glutamato adicionar 2M e 5μL de 800mm malato para obter uma concentração final de 10mM e 2mm, respectivamente. Essas titulações permitir a determinação do complexo basal I-suportado respiração (estado 2; ausência de ADP). Fluxo de oxigênio deverá estabilizar dentro de aproximadamente 5min de titulação. Preparação adequada deve fornecer muito reprodutíveis Estado consumo de oxigênio 2.
5. Após 2-5min de consumo de oxigênio estável, adicionar 20μL de ADP 500mM para uma concentração final de 5mM (saturação), utilizando uma micro Hamilton 25μL, para a respiração (estado 3) máxima mitocondrial através de estudos complexos I. Poucos usar esta alta de uma concentração da ADP, no entanto, é importante notar que a saturação superior a 90% só é atingida em concentrações acima de ⁷ 5mm.
6. Após 2-5min de consumo de oxigênio estável, adicione 5μL de 4mm citocromo c para obter uma concentração final de 10μM, usando uma micro Hamilton 10μL, para análise de controle de qualidade da membrana mitocondrial externa (OMM) integridade.
7. Após 2-5min de consumo de oxigênio estável, adicione 1μL de 4mg / oligomicina mL, utilizando uma micro Hamilton 10μL, para inibir a ATP sintase. Esta etapa vai oferecer titulação validação de intacto membrana interna da mitocôndria.
8. Após a avaliação OXPHOS respirométrico. A amostra é retida para o peso seco ou determinação do marcador mitocondrial.
9. Remover MiR05 das câmaras de vidro do oxygraph. Lavar as câmaras de pelo menos três vezes com água destilada (DDH ₂ O).
10. Lavar as câmaras de pelo menos três vezes com etanol 100% (EtOH) para remover EtOH solúvel inibidores tais como oligomicina.
11. Lavar as câmaras com 70% EtOH três vezes com o final de EtOH 70% lavar 30min duradoura para esterilizar as câmaras oxygraph.
12. Antes da adição de MiR05 para o protocolo de titulação experimental garantir as câmaras que contêm o POS são lavados pelo menos cinco vezes com DDH ₂ O.
13. Da titulação de validação pode ser realizada como um protocolo individual (Figura 2) ou da titulação podem ser incluídos em um protocolo de titulação bem planejada de acordo com os objectivos experimentais e de diagnóstico dos estudos de respirometria.

4. Resultados representativos:

Consumo de oxigênio em devidamente preparado murino fibras cardíacas é avaliada pelo protocolo de controle de qualidade como mostrado na Figura 2. Figuras 3-5 fornecem exemplos comumente encontrados de forma incorreta preparado fibras cardíacas. A relação de controle respiratório (RCR) representa um índice importante na respirometria. Este parâmetro indica o acoplamento entre o consumo de oxigênio ea fosforilação oxidativa. Em preparações de fibras permeabilizadas, a RCR é a taxa de respiração em estado relativo 3 para o estado 2 estado 3 ou, alternativamente, sobre o estado 4 (induzida por oligomicina e / ou Atractilosídeo, ATR). Além disso, RCR pode ser usado como um marcador de garantia de qualidade e pode identificar alterações no acoplamento resultantes das intervenções experimentais ou patológicas ^5. Bem-coupled permeabilizadas murino preparações cardíacas produzir um RCR entre 3-6, dependendo da solução de incubação utilizada ^{1, 8, 9.}

A titulação do citocromo c é usado como uma validação de preparação adequado dos tecidos. Citocromo c é uma proteína localizada no espaço intermembranar na membrana mitocondrial interna ^10. Quando a membrana externa da mitocôndria está intacta, o citocromo c endógena permanece no espaço intermembranar ea titulação de exógenos citocromo c tem um efeito insignificante sobre a respiração (Figura 2). Se a membrana externa da mitocôndria está danificado, o endógeno citocromo c pode ser liberado a partir do espaço intermembranar e vai inibir a respiração até exógenos citocromoc adição (Figura 3). Preparação adequada deve experimentar apenas uma ligeira elevação no fluxo de oxigénio na sequência do citocromo c além na faixa de 5-15% ^5. Além disso, esta titulação experimental permite a avaliação da influência do estressor patológica ou experimental sobre intacto membrana mitocondrial externa. Se um citocromo c efeito é experiente, assegurar os cuidados durante a preparação mecânica do tecido e / ou reduzir a concentração de saponina.

A adição de oligomicina e / ou ATR é utilizado para avaliar alterações na respiração fugas; consumo de oxigênio não contribuindo para a ADP fosforilação ^11. Além disso, esta etapa de titulação pode ser usado como uma validação de preparação de amostras adequadas. Fibras de controle ou do tipo selvagem deve ser sensível a esta adição e experimentar uma redução significativa no fluxo de oxigênio. A RCR baixo e reduzida sensibilidade à oligomicina e / ou ATR, resultando em um fluxo de oxigênio relativamente elevada indica dano à membrana mitocondrial interna durante a preparação (Figura 4). Dano é provavelmente induzida durante a separação mecânica das fibras cardíacas, como a membrana mitocondrial interna é menos suscetível a insultar por saponina em relação à membrana mitocondrial externa. No entanto, tanto a preparação mecânica e química pode ter de ser ajustada em conformidade, para evitar mal preparada fibras cardíacas ^{5, 12.}

Os feixes de fibra saponina de pele de ratos não devem permanecer na solução de RP por mais de 6h ou a solução MiR05 por mais de 2h. Falta de resposta ao substrato inibidor desacoplador-titulações como visto na Figura 5 podem ser indicativos de períodos de incubação prolongada. Esforços subseqüentes deve minimizar os períodos entre o sacrifício de animais e medição do consumo de oxigênio.

Figura 1. Preparação mecânica de murino feixes de fibras cardíacas. A. dissecção O coração inteiro imediatamente seguinte. B. A amostra de 10-25mg do ventrículo anterior esquerda. C. tecido cardíaco separados em um milímetro de diâmetro e tiras de 2-4mm de comprimento. D. final feixes de fibras cardíacas pronto para permeabilização química com saponina.

Figura 2. Os resultados representativos de preparação adequado dos tecidos, utilizando avaliação polarográfico. O estado de fluxo de oxigênio 2 é suportado pelo complexo I substratos glutamato e malato (M / G) e é significativamente estimulada após a adição de ADP (estado 3). Nenhum efeito estimulador do exógenos além citocromo c indica a membrana mitocondrial externa está intacta. Sensibilidade do consumo de oxigênio para oligomicina sugere a integridade da membrana mitocondrial interna está intacta. Concentração de oxigênio em uma câmara fechada 2 mL é identificado pela linha azul. Consumo de oxigênio da amostra de tecido cardíaco em uma câmara fechada 2 mL é representada pela linha vermelha. Malato e glutamato, M / G; adenosina difosfato, a ADP; citocromo c, Cyto c; oligomicina, o.

Figura 3. Citocromo c teste de validação efeito utilizando avaliação polarográfico. O estado de fluxo de oxigênio 2 é suportado pelo complexo I substratos glutamato e malato (M / G) e é significativamente estimulada após a adição de ADP (estado 3). Efeito estimulante do exógenos além citocromo c indica a integridade da membrana externa mitocondrial é comprometida. Concentração de oxigênio em uma câmara fechada 2 mL é identificado pela linha azul. Consumo de oxigênio da amostra de tecido cardíaco em uma câmara fechada 2 mL é representada pela linha vermelha. Malato e glutamato, M / G; adenosina difosfato, a ADP; citocromo c, Cyto c.

Figura 4. Mitocondrial interna da membrana teste de validação de integridade utilizando avaliação polarográfico. O estado de fluxo de oxigênio 2 é suportado pelo complexo I substratos glutamato e malato (M / G) e um estímulo relativamente fraca do consumo de oxigênio após a adição de ADP (estado 3). Pouca sensibilidade do consumo de oxigênio para oligomicina sugere a membrana mitocondrial interna é danificada. Concentração de oxigênio em uma câmara fechada 2 mL é identificado pela linha azul. Consumo de oxigênio da amostra de tecido cardíaco em uma câmara fechada 2 mL é representada pela linha vermelha. Malato e glutamato, M / G; adenosina difosfato, a ADP oligomicina, o.

Figura 5. Polarográfico seguinte avaliação de incubação prolongada em MiR05. Consumo de oxigênio é insensível à adição exógena de glutamato e malato (M / G) e consumo de oxigênio após a adição de ADP (estado 3) é reduzida. Não há efeito estimulante do exógenos além citocromo c e insensibilidade do consumo de oxigênio para oligomicina é experiente. Falta de resposta a adições para a solução de incubação extramitochondrial sugere estabilidade funcional mitocondrial é comprometida. Concentração de oxigênio em uma câmara fechada 2 mL é identificado pela linha azul. Consumo de oxigênio da amostra de tecido cardíaco em uma câmara fechada 2 mL é representada pela linha vermelha. Malato e glutamato, M / G; adenosina difosfato, a ADP; citocromo c, Cyto c.

1. Notas: Preparação do Reagente
Preparação de K ₂ Solução stock EGTA 100mM

Nota: Ajuste o pH para 7,4 em temperatura ambiente.

Preparação de Ca ₂ Solução stock EGTA 100mM

Nota: Ajuste o pH para 7,4 em temperatura ambiente.

Preparação de Relaxamento e solução de preservação (Solução RP) ¹

Nota: Ajuste o pH para 7,1 em temperatura ambiente

Preparação da solução respirometria mitocondrial (MiR05 Solution) ²

Nota: Ajuste o pH para 7,1 a 30 ° C

3. Notas: Análise OXPHOS respirométricos
Substratos B. Select, desacopladores e inibidores

Lista de selecionados para análise Substratos respirometria mitocondrial

Inibidores da lista de selecionados para análise mitocondrial respirometria

A saponina técnica das fibras cardíacas permeabilizadas oferece um compromisso único entre in vitro e in vivo de avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial OXPHOS. Vantagens desta técnica incluem o aumento da relevância fisiológica em comparação com mitocôndrias isoladas como arquitetura celular é preservada. Enquanto a membrana plasmática é degradado, as estruturas de membrana intracelular, incluindo ^{12 mitocôndrias, 14,} retículo sarcoplasmático ^14, miofilamentos eo citoesqueleto ^{1, 17} permanecem intactos. Além disso, as interações entre mitocôndrias e citoesqueleto ^{1, 17} também são inalterados. Mitocôndrias nas fibras permeabilizadas mostram uma maior estabilidade. Preparações de fibra de roedores podem ser armazenados em soluções gelada preservações para amostras de fibra 6h e humanos mostram estabilidade para ^18,2 até 24h. Equilíbrio experiência mitocôndrias rápida com a solução de incubação. Isso permite um controle direto sobre o site-specific análise da cadeia de transporte de elétrons em resposta a substratos adicionados, inibidores e desacopladores ^{1, 5.} Além disso, este in situ requer apenas alguns miligramas de tecido.

Limitações da técnica de fibra saponina de pele não pode ser ignorado. Mitocôndria cardíaca são heterogêneas, que consiste em duas subpopulações;. Subsarcolemais e interfibrilar Na ventilometria mitocondrial situ avalia o total da população mitocondrial sem a capacidade de distinguir entre as ^cinco subpopulações. Além disso, vários metabólitos celulares e fatores citosólicos regular a função mitocondrial. Estes componentes citosólicos das fibras cardíacas são perdidos durante o processo de permeabilização resultando na incapacidade para avaliar mitocondrial no exato in vivo ambiente ^5.

Questões relatórios são uma preocupação importante. Medições de consumo de oxigênio pode ser expressa por peso úmido ou peso seco, no entanto, a densidade mitocondrial é um fator importante na heterogeneidade de fluxo respiratório quando expresso por massa de tecido ^7. É importante compreender que a interpretação das taxas respiratórias e alterações são muito influenciados pela escolha do estado de referência. Comparações diretas dos resultados respirométrico OXPHOS em fibras permeabilizadas, as taxas devem ser expressas em relação a um marcador de referência comuns, tais como DNA mitocondrial, atividade da citrato sintase, a atividade da oxidase do citocromo c, e / ou conteúdo Aa3 citocromo ^19.

Em resumo, a preparação de fibras permeabilizadas usado em conjunto com a análise de respirometria permite a avaliação da função integrativa da mitocôndria cardíaca. Vários estados patológicos e modelos genéticos têm utilizado esta técnica. Estes incluem a avaliação da toxicidade induzida por drogas, envelhecimento, diabetes, insuficiência cardíaca congestiva, lesão de isquemia e estresse oxidativo na fisiologia mitocondrial ^{5, 20.} Vários excelentes revisões metodológicas e manuscritos da técnica de fibra saponina permeabilizadas e avaliação do consumo de oxigênio polarográfico foram previamente publicados ^{1, 5, 14, 20} e são altamente recomendados.