Respirometric oxidativ fosforylering Bedömning i Saponin-permeabilized Cardiac Fibrer

1. Reagensberedning

1. Den avslappning och bevarande lösning (RP Solution) är beredd som tidigare beskrivits med smärre modifieringar ^1. I korthet bestÃ¥r RP Lösning av 2.77mM CAK ₂ EGTA, 7.23mM K ₂ EGTA, 20mm imidazol, 0.5mm ditiotreitol, 20mm taurin, 50mm K-MES, 6,56 MgCl _2, 5.7mm ATP, 14.3mm phosphocreatine, pH 7,1 justeras, i rumstemperatur (RT). Filtrera lösningen genom ett 0,45-ìm filter för att sterilisera. Dela upp i 15 ml (Falcon polypropenrör) och förvara vid -20 ° C Se diskussionen för recept.
2. Det mitokondriella respiration Solution (MiR05) bereds som tidigare beskrivits ² och innehÃ¥ller 0,5 mm EGTA, 3mm MgCl ₂ 0,6 H ₂ O, 20mm taurin, 10mm KH ₂ PO _4, 20mm HEPES, 1g / L BSA, 60mm kalium-lactobionate, 110mm sackaros, pH 7,1, justerat vid 30 ° C. Filtrera lösningen genom ett 0,45-ìm filter för att sterilisera. Dela upp i 50 ml (Falcon polypropenrör) och förvara vid -20 ° C. Se diskussion för recept. Syret lösligheten faktorn för MiR05 vid 30 ° C och 37 ° C är 0,92 ^3.

2. Tissue Förberedelser

A. Hjärtat fibrer Mekanisk preparation

1. Förfaranden godkändes av University of Calgary Djurvård och användning kommittén och följa den kanadensiska Föreningen för Laboratory riktlinjer husdjursvetenskap för experiment.
2. Halsdislokation att immobilisera musen är den metod som föredras. Alternativt kan intraperotineal (IP) injektion av ketamin och xylazin (80 och 10mg/kg, respektive) eller 0.5mg/kg natrium pentobarbital ges. Obs: Natrium pentobarbital är en reversibel hämmare av NADH dehydrogenas (komplex I) ^4.
3. Ta ut hjärtat och placera den i en Petri-skål som innehåller RP lösningen på is (Figur 1A). Ta försiktigt bort all bindväv och / eller matfett i en dissektion mikroskop.
4. Skär hjärtat i hälften längs membranet. Punktskatter 10-25mg våtvikt (ww) av vävnad genom att skära från endokardiet ytan av vänster kammare (Figur 1B). Se till att snitt längs fibern orientering för att minimera mekaniska skador på hjärtmuskeln.
5. Placera dissekerade, delprov av vävnad i en separat Petri-skålen innehåller RP lösningen på is. Med hjälp av en dissektion mikroskop skär i hjärtat i längsgående remsor längs fiberorientering med en diameter på 1-1.5mm.
6. Korta band med en skalpell i längder av 2-4mm (Figur 1C).
7. Använda extrem försiktighet och vassa pincett mekaniskt separata fiberknippen. Slutlig fiberknippen bör innehålla högst 6-8 fibrer, som förbinds med små områden av kontakt, väger inte mer än 5 mg ww. Hjärtat fibrer av 1-3mg ww rekommenderas. Visuellt bör hjärtvävnad ändras från originalet rött till en ljusrosa färg (figur 1D).

B. Hjärt fiberknippen kemiskt preparat

1. Placera en 12-brunnar på is.
2. Skölj väl (s) med RP lösning för att minimera kalcium kontamination ^5.
3. Överför mekaniskt beredd fiberknippen till en brunn som innehåller 3 ml iskall RP lösning med 50ug / ml saponin. Obs: Koncentrationen av saponin beror inte på mängden hjärtmuskeln närvarande i lösningen.
4. Inkubera i 20 minuter med mild omrörning på is.

C. Hjärt Fiber Bundle Tvätt

1. Skölj en ny brunn med MiR05 att minimera kalcium kontamination ^5.
2. Överför hjärt buntar till den nya brunnen innehåller 10mL iskall MiR05. Inkubera i 10 min med lätt omrörning på is.
3. Upprepa (1-2) 2-3 gånger med färsk MiR05. Den repetitiva tvätt steg är att se till att avskaffa eller saponin, ATP, ADP och resterande substrat från fiberknippen.

D. våtvikt beslutsamhet

1. Direkt före luftvägarna analys, är våtvikt erhålls genom blotting den enskilde fiberknippen (1-3mg WW) på en absorberande yta (filterpapper) med hjälp av pincett och hålla fiber till ytan för 5s eller tills all fukt är onda borta.
2. Använda en annan absorberande ytan, ta bort överflödig vätska från tång.
3. Tare skalan och placera fiber bylte på en plast väger båten för massa mätning.
4. Överför hjärt fiber bunten till en ny brunn med iskallt MiR05. Fibern bunt är klar för syreförbrukning bedömning.

3. Respirometric OXPHOS Analys

A. Respirometric Utrustning

1. Laboratoriet använder och rekommenderar en två kammare titrering-injektion oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros instrument). Den Oxygraph 2-k erbjuder hög upplösning respiration till stor del genom att utnyttja instrumentell hårdvara och mjukvara (DatLab) som minimerar instrumentella bakgrund som bidrar tillsyreförbrukning artefakter.
2. Kalibrering av oxygraph är ett viktigt steg för att minimera störande effekter av instrumentala syreförbrukning. Kalibrering varierar något beroende på oxygraph. Se oxygraph bruksanvisning för särskilda förfaranden.

B. representant kvalitetsstyrning / Teknik valideringsprotokoll

1. Se till MiR05 har lagts till oxygraph kammare bostäder polarographic syresensorer (POS) och ge tillräcklig tid för luft mättnad och jämvikt i MiR05 vid 37 ° C före sätta murina hjärt fibermaterial till oxygraph kamrarna.
2. Den kardiella fiber proverna placeras i rörde MiR05 av oxygraph kamrarna. Obs: Kontrollera att rör staplarna är PVDF-eller PEEK-belagd omrörare barer (6 mm diameter).
3. Använda en syre-spruta, ökar syrekoncentrationen i den oxygraph kamrarna till 250-550uM. Det bör noteras att syrehalten är begränsande för permeabilized fiber förberedelser till och med 50% över luftmättnadsvärdet ^6. Låt 5-10min för syrehalten stabilisering.
4. Med hjälp av en 25μL Hamilton mikrospruta lägga 10μL av 2M glutamat och 5μL av 800mm malat att framställa en slutlig koncentration av 10 mm och 2 mm, respektive. Dessa titreringar möjliggör bestämning av basala komplex I-stött andning (staten 2, frånvaro av ADP). Syre flux ska stabiliseras inom ca 5min titrering. Rätt förberedelse bör ge mycket reproducerbara tillstånd 2 syreförbrukning.
5. Efter 2-5min av stabila syreförbrukning, lägg 20μL av 500mm ADP för en slutlig koncentration av 5mm (mättar), med hjälp av en 25μL Hamilton mikrospruta för maximal (State 3) mitokondrie andning genom komplexa I. Få studier använder denna höga av en koncentration av ADP, är det dock viktigt att notera att mer än 90% mättnad bara nås vid koncentrationer över 5 mm ^7.
6. Efter 2-5min av stabila syreförbrukning, lägg 5μL av 4mm cytokrom c för att få en slutlig koncentration av 10μM, med hjälp av en 10μL Hamilton mikrospruta för kvalitetskontroll analys av yttre mitokondriella membranet (OMM) integritet.
7. Efter 2-5min av stabila syreförbrukning, lägg 1μL 4 mg / ml oligomycinkänslig, med hjälp av en 10μL Hamilton mikrospruta att hämma ATP-syntas. Denna titrering steg kommer att erbjuda validering av inre mitokondrie membranet intactness.
8. Efter respirometric OXPHOS bedömningen. Provet sparas för torrvikt eller mitokondriella markör beslutsamhet.
9. Ta MiR05 frÃ¥n glaset kamrarna i oxygraph. Tvätta kamrarna minst tre gÃ¥nger med destillerat vatten (DDH ₂ O).
10. Tvätta kamrarna minst tre gånger med 100% etanol (EtOH) för att ta bort EtOH-lösliga hämmare såsom oligomycinkänslig.
11. Tvätta kammare med 70% EtOH tre gånger med den slutliga 70% EtOH tvätta varar 30min att sterilisera oxygraph kamrarna.
12. Innan tillägg av MiR05 för nya experimentella titrering protokollet att kamrarna innehÃ¥ller POS tvättas minst fem gÃ¥nger med DDH ₂ O.
13. Validering titreringar kan utföras som ett givet protokoll (Figur 2) eller titreringarna kan ingå i en välplanerad titrering protokoll beroende på experimentella och diagnostiska syften respiration studierna.

4. Representativa resultat:

Syreförbrukning i ordentligt förberedd murina hjärt fibrer utvärderas av kvalitetskontroll protokoll som visas i figur 2. Siffrorna 3-5 ger vanligt förekommande exempel på felaktigt förberedda hjärt fibrer. Den respiratoriska kontrollen (RCR) är ett viktigt index i respiration. Denna parameter anger kopplingen mellan syreförbrukning och oxidativ fosforylering. I permeabilized fiber preparat är RCR graden av andning i statliga 3 i förhållande till status 2 eller alternativt tillstånd 3 över statliga 4 (induceras av oligomycinkänslig och / eller atractyloside, ATR). Dessutom kan RCR användas som en kvalitetssäkring markör och kan identifiera förändringar i kopplingen till följd av experimentella eller patologiska interventioner ^5. Väl kopplad permeabilized murin hjärtsjukdomar ger en RCR mellan 3-6 beroende på inkubationen lösningen används ^{1, 8, 9.}

Titrering av cytokrom c används som en validering av riktig vävnad förberedelse. Cytokrom c är ett protein som finns i intermembrane utrymme i mitokondriernas inre membran ^10. När det yttre membranet av mitokondrier är intakt, förblir endogena cytokrom C i intermembrane utrymme och titrering av exogena cytokrom C har en försumbar effekt på andningen (Figur 2). Om det yttre membranet av mitokondrier är skadad kan den endogena cytokrom c frigöras från intermembrane utrymme och kommer att hämma andning tills exogena cytokromc Dessutom (Figur 3). Rätt förberedelser bör uppleva endast en liten förhöjning i syre flux efter cytokrom c tillskott i 5-15% intervallet ^5. Dessutom ger detta experimentella titrering för bedömning av patologiska eller experimentell stressfaktorer påverkan på mitokondriernas yttre membran intactness. Om ett cytokrom c effekt är erfarna, säkra vård under mekanisk utarbetandet av vävnad och / eller minska saponin koncentration.

Tillägget av oligomycinkänslig och / eller ATR används för att bedöma förändringar i läcker andning, syreförbrukning inte bidrar till ADP fosforylering ^11. Dessutom kan detta titrering steg användas som en validering av lämplig provberedning. Control eller vildtyp fibrer bör vara lyhörd för detta tillägg och uppleva en betydande minskning av syre flux. En låg RCR och minskad känslighet för oligomycinkänslig och / eller ATR resulterar i en relativt förhöjda oxygen flux visar på skador i inre mitokondrie membranet under beredning (Figur 4). Skador kommer troligen framkallas under mekanisk separation av hjärt fibrer som det inre mitokondrie membranet är mindre känslig för förolämpning saponin i förhållande till det yttre mitokondriella membranet. Däremot kan både mekaniska och kemiska preparat måste justeras för att undvika felaktigt förberedda hjärt fibrer ^{5, 12.}

Den saponin väggar fiberknippen från möss bör inte stanna kvar i RP lösning för mer än 6h eller MiR05 lösning för mer än 2 timmar. Bristande respons på substrat-hämmare-uncoupler titreringar som visas i Figur 5 kan indikera längre inkubationstider. Efterföljande insatser bör minimera perioder mellan djuroffer och syre mätningar konsumtion.

Figur 1. Mekanisk beredning av murina hjärt fiberknippen. A. Hela hjärtat omedelbart efter dissektion. B. En 10-25mg urval av de främre vänster kammare. C. hjärtvävnad delas upp i 1 mm diameter och 2-4mm remsor längd. D. Slutlig hjärt fiberknippen redo för kemiska permeabilization med saponin.

Figur 2. Representativa resultat av korrekt vävnad förberedelse utnyttja polarographic bedömning. Staten 2 syre flux stöds av komplexa Jag substrat glutamat och malat (M / G) och är betydligt stimuleras efter tillägg av ADP (State 3). Inga stimulerande effekt av exogena cytokrom c Dessutom visar det yttre mitokondriella membranet är intakt. Känslighet för syreförbrukning till oligomycinkänslig tyder på det inre mitokondriemembranbarriären är intakt. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP, cytokrom c, Cyto c; oligomycinkänslig, O.

Figur 3. Cytokrom c effekten valideringstest utnyttja polarographic bedömning. Staten 2 syre flux stöds av komplexa Jag substrat glutamat och malat (M / G) och är betydligt stimuleras efter tillägg av ADP (State 3). Stimulerande effekten av exogent cytokrom c Dessutom visar det yttre mitokondriemembranbarriären äventyras. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP, cytokrom c, Cyto C.

Figur 4. Inre mitokondriemembranbarriären valideringstest utnyttja polarographic bedömning. Staten 2 syre flux stöds av komplexa Jag substrat glutamat och malat (M / G) och en relativt svag stimulering av syreförbrukning efter tillägg av ADP (State 3). Dålig känslighet syreförbrukning till oligomycinkänslig tyder på det inre mitokondrie membranet är skadat. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP oligomycinkänslig, O.

Figur 5. Polarographic bedömning efter långvarig inkubation i MiR05. Syreförbrukning är okänslig för exogen tillsats av glutamat och malat (M / G) och syreförbrukning efter tillägg av ADP (State 3) minskar. Det finns ingen stimulerande effekt av exogena cytokrom c tillägg och okänslighet för syreförbrukning till oligomycinkänslig upplevs. Bristande respons på tillägg till extramitochondrial inkubation lösning föreslår mitokondriella funktionell stabilitet äventyras. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP, cytokrom c, Cyto C.

1. Anteckningar: Reagensberedning
Beredning av K ₂ EGTA 100mm stamlösning

Obs: Justera pH till 7,4 vid rumstemperatur.

Beredning av Ca ₂ EGTA 100mm stamlösning

Obs: Justera pH till 7,4 vid rumstemperatur.

Beredning av Avkoppling och Preservation Solution (RP Solution) ¹

Obs: Justera pH till 7,1 vid rumstemperatur

Beredning av Mitokondriell respiration Solution (MiR05 Solution) ²

Obs: Justera pH till 7,1 vid 30 ° C

3. Anteckningar: Respirometric OXPHOS Analys
B. Välj substrat uncouplers och inhibitorer

Lista på utvalda substrat för mitokondriernas respiration analys

Förteckning över vissa hämmare för mitokondriernas respiration analys

Den saponin-permeabilized hjärt fiber tekniken erbjuder en unik kompromiss mellan in vitro och in vivo utvärdering av mitokondrie OXPHOS syreförbrukning. Fördelar med denna teknik är bland annat ökad fysiologisk betydelse i jämförelse med isolerade mitokondrier som cellulära arkitektur är bevarad. Medan plasmamembran bryts ned, intracellulära membran strukturer inklusive mitokondrierna ^{12, 14,} sarkoplasmatiska nätmagen ^14, myofilamenten och cytoskelettet ^{1, 17} förblir intakt. Dessutom är samspelet mellan mitokondrierna och cytoskelettet ^{1, 17} är också oförändrade. Mitokondrierna i permeabilized fibrer visa ökad stabilitet. Gnagare fiber förberedelser kan lagras i iskallt preservations lösningar för 6h och mänsklig fiber prover visar stabilitet i upp till 24h ^18,2. Mitokondrier erfarenhet snabb jämvikt med inkubation lösningen. Detta möjliggör direkt kontroll över platsspecifika analys av elektron transportkedjan som svar lagt substrat hämmare och uncouplers ^{1, 5.} Dessutom kräver detta på plats tekniken bara några milligram av vävnad.

Begränsningar av saponin skal fiber teknik kan inte ignoreras. Hjärtat mitokondrierna är heterogena, bestående av två subpopulationer,. Subsarcolemmal och interfibrillar In situ mitokondrie respiration bedömer den totala mitokondrie befolkningen utan möjlighet att skilja mellan subpopulationer ^5. Dessutom olika cellulära metaboliter och cytosola faktorer som reglerar mitokondriell funktion. Dessa cytosoliskt komponenter i hjärt fibrerna går förlorade under permeabilization process som leder till en oförmåga att bedöma mitokondrie på exakt in vivo-miljö ^5.

Rapportering frågor är en viktig fråga. Syreförbrukning mätningar kan anges per våtvikt eller torrvikt är dock mitokondrie täthet en viktig faktor i luftvägarna flux heterogenitet uttryckt per vävnadsmassa ^7. Det är viktigt att förstå att tolkningen av andningsfrekvens och förändringar är starkt präglat av valet av referens stat. För direkta jämförelser av respirometric OXPHOS resulterar i permeabilized fibrer, måste priserna uttryckas i förhållande till en gemensam referens markör som mitokondrie-DNA, citrat syntasaktivitet, cytokrom c oxidas aktivitet och / eller cytokrom Aa3 innehåll ^19.

Sammanfattningsvis tillåter permeabilized fiber preparat som används i samband med respiration analys för bedömning av integrerande funktion av hjärt mitokondrier. Olika sjukdomstillstånd och genetiska modeller har utnyttjat denna teknik. Dessa inkluderar utvärdering av läkemedelsinducerad toxicitet, åldrande, diabetes, hjärtsvikt, ischemisk skada och oxidativ stress på mitokondriell fysiologi ^{5, 20.} Flera goda metodologiska omdömen och manuskript av saponin-permeabilized fiber teknik och polarographic syreförbrukning bedömning har tidigare publicerats ^{1, 5, 14, 20} och kan verkligen rekommenderas.