Respirometrische oxidatieve fosforylering Assessment in Saponin-gepermeabiliseerde Cardiac Vezels

1. Bereiding van het reagens

1. De ontspanning en het behoud oplossing (RP Solution) is bereid zoals eerder beschreven met kleine aanpassingen ^een. Kortom, de RP-oplossing bestaat uit 2.77mM CAK ₂ EGTA, 7.23mM K ₂ EGTA, 20mm imidazol, 0.5mm dithiothreitol, 20mm taurine, 50 mM K-MES, 6,56 MgCl _2, 5.7mm ATP, 14.3mM phosphocreatine, pH 7,1, aangepast bij kamertemperatuur (RT). Filtreer de oplossing door een 0,45-um filter om te steriliseren. Verdeel het deeg in 15 ml (Falcon polypropyleen buizen) en bewaar bij -20 ° C Zie de bespreking voor recepten.
2. De Mitochondriale respirometrietest Solution (MiR05) is bereid zoals eerder beschreven en bevat ^twee 0,5 mm EGTA, 3mm _MgCl2 0,6 H ₂ O, 20mm taurine, 10mm KH ₂ PO _4, 20mm HEPES, 1 g / L BSA, 60mm kalium-lactobionate, 110mm sucrose, pH 7,1, aangepast bij 30 ° C. Filtreer de oplossing door een 0,45-um filter om te steriliseren. Verdeel het deeg in 50 ml porties (Falcon polypropyleen buizen) en bewaar bij -20 ° C. Zie de bespreking voor de recepten. De zuurstof oplosbaarheid factor voor MiR05 bij 30 ° C en 37 ° C is 0,92 ^3.

2. Tissue Voorbereiding

A. Cardiac vezels mechanische voorbereiding

1. Procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Calgary Dierverzorging en gebruik Comite en zich houden aan de Canadese Vereniging voor Proefdierkunde richtlijnen voor experimenten.
2. Cervicale dislocatie om de muis te immobiliseren is de voorkeur. Als alternatief kan intraperotineal (IP) injectie van ketamine en xylazine (80 en 10mg/kg, respectievelijk) of 0.5mg/kg van natriumpentobarbital worden toegediend. Let op: natriumpentobarbital is een reversibele remmer van NADH dehydrogenase (complex I) ^4.
3. Verwijder het hart en plaats deze in een petrischaal met de RP-oplossing op ijs (Figuur 1A). Verwijder voorzichtig het bindweefsel en / of vet met behulp van een dissectie microscoop.
4. Snijd het hart in half langs het septum. Accijnzen 10-25mg natgewicht (WW) van weefsel door te snijden van het endocard oppervlak van het linker ventrikel (figuur 1B). Zorg ervoor dat incisie langs de vezeloriëntatie te minimaliseren mechanische schade aan de hartspier.
5. Plaats de ontleed, subgroep van weefsel in een aparte petri-schaaltje met de RP-oplossing op het ijs. Met behulp van een dissectie microscoop snijden het hart in de longitudinale stroken langs vezeloriëntatie met een diameter van 1-1.5mm.
6. Verkort de strips met een scalpel een lengte van 2-4mm (figuur 1C).
7. Met behulp van uiterste zorg en een scherpe tang mechanisch gescheiden vezelbundels. Final vezelbundels zou moeten bevatten een maximum van 6-8 vezels, verbonden door kleine gebieden van contact, met een gewicht van niet meer dan 5 mg ww. Cardiale vezels van 1-3 mg ww worden aanbevolen. Visueel moet het hartweefsel verandering van de oorspronkelijke rood naar een lichtroze kleur (figuur 1D).

B. Cardiac vezelbundels chemische preparaten

1. Plaats een 12-wells plaat op het ijs.
2. Spoel de put (s) met RP oplossing voor calcium besmetting te minimaliseren ^5.
3. Breng het mechanisch voorbereid vezelbundels om een ​​putje met 3 ml ijskoude RP oplossing met 50ug / ml saponine. Opmerking: De concentratie van saponinen is niet afhankelijk van de hoeveelheid van de hartspier in de oplossing aanwezig.
4. Incubeer 20 minuten met een lichte roeren op het ijs.

C. Cardiac vezelbundel Wassen

1. Spoel een nieuw goed met MiR05 aan calcium besmetting te minimaliseren ^5.
2. Breng de cardiale bundels naar de nieuwe putje met 10 ml ijskoud MiR05. Incubeer 10min met milde roeren op het ijs.
3. Herhalen (1-2) 2-3 keer met verse MiR05. Het repetitieve wasstappen zijn voor de verwijdering of saponine, ATP, ADP en de resterende substraten van de vezelbundels te verzekeren.

D. Rijklaar gewicht bepalen

1. Direct voorafgaand aan de luchtwegen analyse, is nat gewicht verkregen door blotting de individuele vezelbundels (1-3 mg ww) op een absorberend oppervlak (filtreerpapier) met behulp van pincet en houden van de vezels aan het oppervlak gedurende 5 seconden of tot al het vocht is slecht weg.
2. Met behulp van een ander absorberend oppervlak, verwijderen overtollige vloeistof uit tang.
3. Tare de schaal en plaats de vezel bundel op een plastic wegen boot voor massa-metingen.
4. Breng de cardiale vezel bundel naar een nieuw goed met ijs-koud MiR05. De vezel bundel is klaar voor zuurstofverbruik beoordeling.

3. Respirometrische OXPHOS Analyse

A. respirometrische Equipment

1. Het laboratorium maakt gebruik van en beveelt een twee kamer titratie-injectie oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). De Oxygraph 2-k biedt een hoge resolutie respirometrie een groot deel door gebruik te maken van instrumentale hard-en software (DatLab) die instrumentele achtergrond minimaliseert die bijdragen aanzuurstofverbruik artefacten.
2. Kalibratie van de oxygraph is een essentiële stap om verstorende effecten van de instrumentele zuurstofverbruik te minimaliseren. Kalibratie varieert enigszins, afhankelijk van de oxygraph. Raadpleeg oxygraph handleiding voor specifieke procedures.

B. Vertegenwoordiger Quality Control / Techniek Validation Protocol

1. Zorg ervoor dat MiR05 is toegevoegd aan oxygraph kamers huisvesting van de polarografische zuurstof sensoren (POS) en geef voldoende tijd voor lucht-verzadiging en evenwichtsinstelling van de MiR05 bij 37 ° C voorafgaand op de invoering van de muizen-cardiale vezels in de oxygraph kamers.
2. De cardiale vezel monsters worden geplaatst in de geroerde MiR05 van de oxygraph kamers. Let op: Zorg ervoor dat het roer bars zijn PVDF-of PEEK-coated roerder bars (6 mm diameter).
3. Met behulp van een zuurstof-spuit, verhoging van de zuurstofconcentratie van de oxygraph kamers om 250-550uM. Opgemerkt moet worden dat de zuurstofconcentratie is beperkend voor gepermeabiliseerde glasvezel preparaten op zelfs 50% boven de airbag van verzadiging ^6. Laat 5-10min voor de zuurstofconcentratie stabilisatie.
4. Met behulp van een injectiespuit 25μL Hamilton, voeg 10μL van 2M glutamaat en 5μL van 800mm malaat tot een uiteindelijke concentratie van 10 mm en 2 mm respectievelijk te krijgen,. Deze titraties zorgen voor de bepaling van de basale complex I-ondersteunde ademhaling (staat 2; afwezigheid van ADP). Zuurstof flux moeten stabiliseren binnen ongeveer 5min van titratie. Een goede voorbereiding moet zeer reproduceerbare staat 2 zuurstof-consumptie.
5. Na de 2-5min van stabiele zuurstof-consumptie, toe te voegen 20μL van 500mm ADP voor een uiteindelijke concentratie van 5mm (verzadiging), met behulp van een injectiespuit 25μL Hamilton, voor maximaal (state 3) mitochondriale ademhaling door middel van complexe I. Er zijn maar weinig studies maken gebruik van deze hoge concentratie van een van ADP, echter, is het belangrijk op te merken dat meer dan 90% verzadiging alleen wordt bereikt bij concentraties boven de 5mM ^7.
6. Na de 2-5min van stabiele zuurstof-consumptie, toe te voegen 5μL van 4mm cytochroom c tot een uiteindelijke concentratie van 10μM krijgen, met behulp van een injectiespuit 10μL Hamilton, voor kwaliteitscontrole analyse van de buitenste mitochondriale membraan (OMM) integriteit.
7. Na de 2-5min van stabiele zuurstof-consumptie, toe te voegen 1μL van 4 mg / ml oligomycin, met behulp van een injectiespuit 10μL Hamilton, om ATP synthase remmen. Deze titratie stap biedt validatie van de innerlijke mitochondriën membraan intact.
8. Naar aanleiding van de respirometrische OXPHOS beoordeling. Het monster wordt bewaard voor droge gewicht of mitochondriale marker vastberadenheid.
9. Verwijder MiR05 van het glas kamers van het oxygraph. Was de kamers ten minste drie keer met gedestilleerd water (DDH ₂ O).
10. Was de kamers ten minste drie keer met 100% ethanol (EtOH) naar EtOH oplosbare remmers, zoals oligomycin te verwijderen.
11. Was de kamers met 70% EtOH drie keer met de laatste 70% EtOH wassen duren 30 minuten tot de oxygraph kamers steriliseren.
12. Voorafgaand aan de toevoeging van MiR05 voor nieuwe experimentele titratie protocol zorgen voor de kamers met de POS zijn ten minste vijf keer gewassen met DDH ₂ O.
13. De validatie titraties kan worden uitgevoerd als een afzonderlijk protocol (figuur 2) of de titraties kunnen worden opgenomen in een goed geplande titratie protocol, afhankelijk van de experimentele en diagnostische doelen van de respirometrie studies.

4. Representatieve resultaten:

Zuurstofverbruik in goed voorbereid muriene hart-vezels wordt geëvalueerd door de kwaliteitscontrole protocol, zoals weergegeven in figuur 2. Figuren 3-5 bieden voorkomende voorbeelden van onjuist bereid cardiale vezels. De respiratoire controle ratio (RCR) is een belangrijke index in respirometrie. Deze parameter geeft aan dat de koppeling tussen zuurstof-consumptie en oxidatieve fosforylatie. In gepermeabiliseerde vezels de voorbereidingen, de RCR is de snelheid van de ademhaling in staat 3 ten opzichte van de staat of als alternatief 2 staat 3 over toestand 4 (geïnduceerd door oligomycin en / of atractyloside, ATR). Bovendien kan RCR gebruikt worden als een kwaliteitsgarantie en de marker kunnen identificeren veranderingen in de koppeling als gevolg van experimentele of pathologische interventies ^5. Goed gekoppeld gepermeabiliseerde murine cardiale preparaten opbrengst een RCR tussen 3-6, afhankelijk van de incubatietijd oplossing gebruikt ^{1, 8, 9.}

De titratie van cytochroom c wordt gebruikt als een validatie van de juiste weefsel voorbereiding. Cytochroom c is een eiwit dat zich in de intermembrane ruimte op de mitochondriale binnenste membraan ^10. Wanneer de buitenste membraan van mitochondriën intact is, de endogene cytochroom c blijft in de intermembrane ruimte en de titratie van exogene cytochroom c heeft een verwaarloosbaar effect op de ademhaling (figuur 2). Als de buitenste membraan van mitochondria is beschadigd, kan de endogene cytochroom c worden vrijgesteld van de intermembrane ruimte en zal de ademhaling remmen tot exogene cytochroomc toevoeging (figuur 3). Een goede voorbereiding moet ervaren slechts een lichte verhoging van de zuurstof flux na cytochroom c toevoeging in de range 5-15% ^5. Bovendien, deze experimentele titratie kan voor de beoordeling van invloed zijn op de pathologische of experimentele stressor's op de mitochondriale buitenste membraan intact. Als een cytochroom c effect wordt ervaren, zorg zorg bij mechanische voorbehandeling van het weefsel en / of te verminderen saponine concentratie.

De toevoeging van oligomycin en / of ATR wordt gebruikt om veranderingen in lekken ademhaling te beoordelen; zuurstofverbruik niet bij te dragen aan ADP fosforylering ^11. Bovendien kan deze titratie stap gebruikt worden als een validatie van een goede monstervoorbereiding. Control of wild-type vezels moet gevoelig zijn voor deze toevoeging en ervaring een significante vermindering van de zuurstof flux. Een lage RCR en verminderde gevoeligheid voor oligomycin en / of ATR wat resulteert in een relatief hoge zuurstof flux geeft schade aan het binnenste mitochondriale membraan tijdens de voorbereiding (figuur 4). Schade is waarschijnlijk veroorzaakt tijdens de mechanische scheiding van de cardiale vezels als het binnenste mitochondriale membraan is minder gevoelig voor beledigen door saponine ten opzichte van de buitenste mitochondriale membraan. Kunnen echter zowel de mechanische en chemische voorbereiding moeten dienovereenkomstig worden aangepast aan ten onrechte zijn hart vezels ^{5, 12} te vermijden.

De saponine-gevilde vezelbundels van muizen mag niet blijven in de RP oplossing voor meer dan 6 uur of de MiR05 oplossing voor meer dan 2u. Gebrek aan respons op substraat-inhibitor-ontkoppelrail titraties zoals te zien is in Figuur 5 kan een aanwijzing zijn voor langere incubatietijd. Latere inspanningen moeten een minimum te beperken periodes tussen het offeren van dieren en zuurstof consumptie metingen.

Figuur 1. Mechanische voorbereiding van muriene cardiale vezelbundels. A. De hele hart direct na dissectie. B. Een 10-25mg steekproef van de voorste linker hartkamer. C. hartweefsel gescheiden in 1 mm diameter en 2-4mm lengte strips. D. Final cardiale vezelbundels klaar voor de chemische permeabilisatie met saponine.

Figuur 2. Representatieve resultaat van een juiste voorbereiding gebruik te maken van weefsels polarografische beoordeling. De staat 2 zuurstofflux wordt ondersteund door complexe I substraten glutamaat en malaat (M / G) en is aanzienlijk gestimuleerd na de toevoeging van ADP (staat 3). Geen stimulerend effect van exogene cytochroom c Daarnaast geeft de buitenste mitochondriale membraan intact is. Gevoeligheid van zuurstof consumptie oligomycin suggereert dat de binnenste mitochondriale membraan integriteit intact is. Zuurstofconcentratie in een 2 ml gesloten kamer wordt geïdentificeerd door de blauwe lijn. Zuurstofverbruik van het hartweefsel monster in een 2 ml gesloten kamer wordt weergegeven door de rode lijn. Malaat en glutamaat, M / G; Adenosine difosfaat, ADP, Cytochroom c, Cyto c; Oligomycin, o.

Figuur 3. Cytochroom c effect validatietest gebruik te maken van polarografische beoordeling. De staat 2 zuurstofflux wordt ondersteund door complexe I substraten glutamaat en malaat (M / G) en is aanzienlijk gestimuleerd na de toevoeging van ADP (staat 3). Stimulerend effect van exogene cytochroom c Daarnaast geeft de buitenste mitochondriale membraan integriteit wordt aangetast. Zuurstofconcentratie in een 2 ml gesloten kamer wordt geïdentificeerd door de blauwe lijn. Zuurstofverbruik van het hartweefsel monster in een 2 ml gesloten kamer wordt weergegeven door de rode lijn. Malaat en glutamaat, M / G; Adenosine difosfaat, ADP, Cytochroom c, Cyto c.

Figuur 4. Binnenste mitochondriale membraan integriteit validatietest gebruik te maken van polarografische beoordeling. De staat 2 zuurstofflux wordt ondersteund door complexe I substraten glutamaat en malaat (M / G) en een relatief zwakke stimulatie van zuurstof verbruik na de toevoeging van ADP (staat 3). Slechte gevoeligheid van de zuurstof consumptie oligomycin suggereert dat de binnenste mitochondriale membraan is beschadigd. Zuurstofconcentratie in een 2 ml gesloten kamer wordt geïdentificeerd door de blauwe lijn. Zuurstofverbruik van het hartweefsel monster in een 2 ml gesloten kamer wordt weergegeven door de rode lijn. Malaat en glutamaat, M / G; Adenosine difosfaat, ADP Oligomycin, o.

Figuur 5. Polarografische evaluatie na langdurige incubatie in MiR05. Zuurstofverbruik is ongevoelig voor exogene toevoeging van glutamaat en malaat (M / G) en zuurstof verbruik na de toevoeging van ADP (staat 3) wordt verminderd. Er is geen stimulerend effect van exogene toevoeging cytochroom c en de ongevoeligheid van zuurstof consumptie oligomycin wordt ervaren. Gebrek aan respons op toevoegingen aan extramitochondrial incubatie-oplossing suggereert mitochondriaal functionele stabiliteit in gevaar wordt gebracht. Zuurstofconcentratie in een 2 ml gesloten kamer wordt geïdentificeerd door de blauwe lijn. Zuurstofverbruik van het hartweefsel monster in een 2 ml gesloten kamer wordt weergegeven door de rode lijn. Malaat en glutamaat, M / G; Adenosine difosfaat, ADP, Cytochroom c, Cyto c.

1. Opmerkingen: Bereiding van het reagens
De voorbereiding van K ₂ EGTA 100mm Stock Solution

Opmerking: Breng de pH tot 7,4 bij kamertemperatuur.

De voorbereiding van Ca ₂ EGTA 100mm Stock Solution

Opmerking: Breng de pH tot 7,4 bij kamertemperatuur.

Voorbereiding van Ontspanning en Conservering Solution (RP Solution) ^een

Opmerking: Breng de pH naar 7,1 bij kamertemperatuur

De voorbereiding van Mitochondriale respirometrie Solution (MiR05 Solution) ²

Opmerking: Breng de pH tot 7,1 bij 30 ° C

3. Opmerkingen: respirometrische OXPHOS Analyse
B. Selecteer Substraten, uncouplers en inhibitoren

Lijst van geselecteerde Substraten voor Mitochondriale respirometrie Analyse

Lijst van geselecteerde remmers voor mitochondriële respirometrie Analyse

De saponine-gepermeabiliseerde cardiale fiber techniek biedt een uniek compromis tussen in vitro en in vivo evaluatie van de mitochondriale OXPHOS zuurstof verbruik. Voordelen van deze techniek zijn onder meer fysiologische relevantie in vergelijking met geïsoleerde mitochondria als cellulaire architectuur is bewaard gebleven. Terwijl de plasmamembraan is afgebroken, intracellulaire membraan structuren met inbegrip van mitochondria ^{12, 14, 14} sarcoplasmatisch reticulum, myofilamenten en het cytoskelet ^{1, 17} intact blijven. Bovendien, de interacties tussen mitochondriën en cytoskelet ^{1, 17} zijn ook ongewijzigd. Mitochondria in gepermeabiliseerde vezels vertonen een verhoogde stabiliteit. Knaagdier vezels preparaten kunnen worden opgeslagen in ijskoud behoud op oplossingen voor 6u en menselijke vezelmonsters tonen stabiliteit voor maximaal 24 uur ^18,2. Mitochondriën ervaring snel evenwicht met de incubatie-oplossing. Dit maakt directe controle over site-specifieke analyse van het elektron transport keten in reactie op toegevoegde substraten, inhibitoren en uncouplers ^{1, 5.} Bovendien wordt met deze in-situ techniek vereist slechts een paar milligram van het weefsel.

Beperkingen van de saponine-huid fiber techniek kan niet worden genegeerd. Cardiale mitochondriën zijn heterogeen, bestaande uit twee subpopulaties;. Subsarcolemmal en interfibrillar In situ mitochondriale respirometrie beoordeelt de totale mitochondriale bevolking zonder de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen de subpopulaties ^5. Bovendien, verschillende cellulaire metabolieten en cytosolische reguleren mitochondriale functie. Deze cytosolische onderdelen van de cardiale vezels verloren zijn gegaan tijdens het permeabilisatie proces dat resulteert in het onvermogen om mitochondriale te beoordelen op de exacte in vivo omgeving ^5.

Het melden van problemen is een belangrijk aandachtspunt. Zuurstofverbruik metingen kunnen worden uitgedrukt per nat gewicht of droog gewicht, echter, mitochondriale dichtheid is een belangrijke factor van de luchtwegen flux heterogeniteit, uitgedrukt per weefselmassa ^7. Het is belangrijk om te begrijpen dat de interpretatie van de luchtwegen tarieven en veranderingen worden sterk beïnvloed door de keuze van de referentie-toestand. Voor directe vergelijkingen van respirometrische OXPHOS resulteert in gepermeabiliseerde vezels, moeten de tarieven worden uitgedrukt ten opzichte van een gemeenschappelijke referentie marker, zoals mitochondriaal DNA, citraat synthase activiteit, cytochroom c oxidase activiteit, en / of cytochroom Aa3 inhoud ^19.

Kortom, de gepermeabiliseerde vezel gebruikt preparaat in combinatie met respirometrie analyse maakt voor de beoordeling van de integratieve functie van de cardiale mitochondriën. Verschillende pathologische toestanden en genetische modellen hebben gebruikt deze techniek. Deze omvatten de evaluatie van de drug-geïnduceerde toxiciteit, veroudering, diabetes, congestief hartfalen, ischemische schade en oxidatieve stress op de mitochondriale fysiologie ^{5, 20.} Verschillende uitstekende methodologische reviews en manuscripten van de saponine-gepermeabiliseerde fiber techniek en polarografische zuurstofverbruik beoordeling van zijn eerder gepubliceerd op ^{1, 5, 14, 20} en worden sterk aanbevolen.