Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

1, 1,2, 2, 1,2

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Calgary, 2Faculty of Kinesiology, University of Calgary

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.22.252.150, User IP: 23.22.252.150, User IP Hex: 387382422

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers. J. Vis. Exp. (48), e2431, doi:10.3791/2431 (2011).

Abstract: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Mitokondri, enerji metabolizması, oksidatif stres, apoptoz, yaşlanma, mitokondriyal encephalomyopathies ve ilaç toksisitesinin yer olarak mitokondriyal fonksiyon araştırılması kalp fizyolojisi önemli bir parametre temsil eder. Bu göz önüne alındığında, kalp mitokondrial fonksiyonu ölçmek için teknolojiler talep vardır. Mitokondrial fonksiyonu ölçmek için bütüncül bir yaklaşım kullanır Bir teknik Söz konusu modelde oksidatif fosforilasyon (Kadıköy) analizi.

Söz konusu modelde Kadıköy değerlendirme ilkesi Clark elektrot kullanan oksijen konsantrasyonu ölçüm etrafında merkezli. Permeabilize elyaf demeti, kapalı oda düşüşler, oksijen, oksijen konsantrasyonu tüketir. Seçilen substrat inhibitörü-uncoupler titrasyon protokolleri kullanarak, elektronlar, mitokondriyal fonksiyon değerlendirme sağlayan, elektron taşıma zinciri belirli siteleri sağlanmaktadır. Kas liflerinin sarcolemma permeabilize, mitokondriyal fonksiyon modelde aynı analizi öncesinde mekanik ve kimyasal hazırlık teknikleri kullanılmaktadır. Kimyasal permeabilization hücresel mimarili korurken seçici hücre zarı perfore saponin kullanmaktadır.

Bu kağıt iyice mitokondriyal Kadıköy değerlendirmek için, oksijen tüketimi ölçümleri için saponin tenli kalp lifleri hazırlanmasında yer alan adımları açıklamaktadır. Ayrıca, danışmanlık hizmetlerinin yanı sıra özel substratlar gidermeye, elektron taşıma zinciri belirli siteleri mitokondri fonksiyonunu belirlemek için kullanılıyor olabilir inhibitörleri ve uncouplers sağlanmaktadır. Önemlisi, açıklanan protokol çeşitli hayvan modellerinde ve insan örnekleri kalp ve iskelet doku kolayca uygulanabilir.

Protocol: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

1. Reaktif Hazırlama

  1. Gevşeme ve koruma solüsyonu (RP Çözüm), daha önce açıklandığı gibi küçük değişiklikler 1 ile hazırlanmıştır . Kısaca, RP Çözüm arındırılmış 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20mm imidazol, 0.5mm dithiothreitol, 20mm taurin, 50mm K-MES, 6.56 MgCl 2, 5,7 mm ATP, 14.3mM phosphocreatine, pH 7.1, oda sıcaklığında (RT). 0.45 mikron filtre ile sterilize etmek için bir çözüm Filtresi. -20 15 ml porsiyon (Falcon polipropilen borular) ve mağaza içine Böl ° C yemek tarifleri için bakınız.
  2. Mitokondrial respirometri Çözümü (MiR05) hazırlanan ve daha önce 2 açıklandığı gibi, potasyum lactobionate 60mm, 110mm 0.5mm EGTA, 3mm MgCl 2 .6 H 2 O, 20mm taurin, 10mM KH 2 PO 4, 20mm Hepes 1g / L BSA, içeren 30 ayarlanabilir sakkaroz, pH 7.1 ° C. 0.45 mikron filtre ile sterilize etmek için bir çözüm Filtresi. -20 ° C'de 50 ml porsiyon (Falcon polipropilen borular) ve mağaza içine Böl Yemek tarifleri için bakınız. 30 MiR05 için oksijen çözünürlüğü faktör ° C ve 37 ° C 0.92 3.

2. Doku hazırlanması

A. Kardiyak liflerin mekanik yüzey hazırlığı

  1. Prosedürler, Calgary Hayvan Bakım Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Komitesi kullanın ve Kanada Derneği Laboratuvar deneyleri için Zootekni kurallarına uymayı
  2. Servikal dislokasyon fare hareketsiz tercih edilen yöntemdir. Alternatif olarak, intraperotineal (IP), ketamin ve ksilizin enjeksiyon (sırasıyla% 80 ve 10mg/kg,) veya pentobarbital sodyum 0.5mg/kg uygulanabilir. Not: pentobarbital Sodyum NADH dehidrogenaz (karmaşık) 4 reversibl bir inhibitörüdür .
  3. Kalp çıkarın ve buz (Şekil 1A) RP çözümü içeren bir petri yemek yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu kullanarak herhangi bir bağ dokusu ve / veya yağ dikkatlice çıkartın.
  4. Septum boyunca yarısında kalp kesin. Sol ventrikül endokard yüzey (Şekil 1B) keserek doku çıkarılarak 10-25mg ıslak ağırlığı (ww). Miyokarda mekanik hasarı en aza indirmek için fiber oryantasyon boyunca olun kesi.
  5. Buz üzerinde RP çözümü içeren petri yemek ayrı bir doku disseke, alt örnek yerleştirin. Diseksiyon mikroskop kullanarak 1-1.5mm çapında fiber oryantasyon boyunca uzunlamasına şeritler halinde kalp kesti.
  6. 2-4mm (Şekil 1C) uzunlukları bir neşter ile şeritler kısaltın.
  7. Aşırı bakım ve mekanik ayrı lif demetleri keskin forseps kullanma. Final lif demetleri 5mg ww daha fazla ağırlıkta olan küçük alanlarda temas bağlı 6-8 liflerinin maksimum içermelidir. 1-3mg ww Kardiyak lifleri tavsiye edilir. Görme, kalp dokusu, soluk pembe renkli boyama (Şekil 1D) orijinal kırmızı değiştirmeniz gerekir.

B. Kardiyak lif demetleri kimyasal hazırlık

  1. Buz üzerinde 12 plaka koyun.
  2. RP 5 kalsiyum kontaminasyonu en aza indirmek için çözüm (ler) ile iyi durulayın.
  3. 50ug / ml saponin ile de içeren bir 3ml buz RP çözüm şerbetini lif demetleri aktarın. Not: saponin konsantrasyonu çözüm kalp kası mevcut miktarına bağlı değildir.
  4. Buz üzerinde hafif karıştırarak 20dk boyunca inkübe.

C. Kardiyak Fiber Demeti Yıkama

  1. 5 kalsiyum kontaminasyonu en aza indirmek için yeni bir de MiR05 ile durulayın.
  2. Buz gibi yeni de içeren 10 ml MiR05 kalp demetleri aktarın. Buz üzerinde hafif karıştırarak 10 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Taze MiR05 tekrarlayın (1-2) 2-3 kez. Tekrarlayan yıkama adımları kaldırılması veya saponin, ATP, ADP ve lif demetleri kalan substratları sağlamak için.

D. Islak ağırlığı tayini

  1. Doğrudan solunum analiz önce, ıslak ağırlık, tek tek lif demetleri (1 3mg ww) forseps kullanarak emici bir yüzey (filtre kağıdı) blot ve 5s için yüzeye fiber tutan veya tüm nemi kötülerin kadar elde edilir.
  2. Başka bir emici yüzey kullanarak, forseps fazla sıvı çıkarın.
  3. Dara ölçek ve plastik bir elyaf demeti kitle ölçümü için tekne tartın.
  4. MiR05 buz yeni bir kuyu kalp elyaf demeti aktarın. Elyaf demeti oksijen tüketimi değerlendirilmesi için hazırdır.

3. Söz konusu modelde Kadıköy Analizi

A. Söz konusu modelde Ekipmanları

  1. Laboratuar, iki odalı bir titrasyon enjeksiyon oxygraph kullanır ve tavsiye (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). Oxygraph 2-k büyük ölçüde katkıda enstrümantal arka plan en aza indirir enstrümantal donanım ve yazılım (DatLab) kullanılarak yüksek çözünürlüklü respirometrioksijen tüketimi eserler.
  2. Oxygraph Kalibrasyon enstrümantal oksijen tüketimi karıştırıcı etkilerini en aza indirmek için önemli bir adımdır. Kalibrasyon oxygraph bağlı olarak biraz değişir. Belirli prosedürleri için oxygraph kullanım kılavuzuna başvurun.

B. Temsilcisi Kalite Kontrol / Teknik Doğrulama Protokolü

  1. MiR05 polarografik oksijen sensörleri (POS) ve 37 MiR05 hava doygunluğu ve dengelenme için yeterli zaman vermek ° C önceden oxygraph odaları içine fare kalp lifler koyarak oxygraph odaları konut eklenmiştir olun.
  2. Kalp lif örnekleri oxygraph odaları karıştırılır MiR05 yerleştirilir. Not: heyecan bar olun PVDF veya PEEK-kaplı karıştırıcı çubuklar (6mm çap).
  3. Oksijen dolu bir şırınga kullanarak, 250-550uM oxygraph odaların oksijen konsantrasyonu artırır. Oksijen konsantrasyonu hava doygunluğu 6 üzerinde bile% 50 permeabilize fiber hazırlıkları için sınırlayıcı olduğunu belirtmek gerekir. 5-10dk oksijen konsantrasyonu istikrar için izin ver.
  4. 25μL Hamilton mikroenjektör kullanarak, sırasıyla, 10mM ve 2mm son bir konsantrasyon elde etmek için 800mm malat 2M glutamat ve 5μL 10μL ekleyin. Bu titrasyonları belirlenmesi için bazal kompleksi Ben destekli solunumu (ADP yokluğunda Devlet 2) izin verir. Oksijen akı titrasyon yaklaşık 5 dk içinde stabilize edilmelidir. Uygun hazırlık, 2 oksijen tüketimi çok tekrarlanabilir devlet vermelidir.
  5. Istikrarlı oksijen tüketimi 2-5sn sonra, karmaşık I. Az sayıda çalışmada ise bu kadar yüksek bir konsantrasyon kullanımı yoluyla maksimum (state 3), mitokondriyal solunum, 25μL Hamilton mikroenjektör kullanarak, 5mM (doyurarak) son bir konsantrasyon için 500mm ADP 20μL eklemek ADP, ancak, sadece% 90 daha fazla doygunluk 5mM 7 üstündeki yoğunluklara ulaşmış olduğunu not etmek önemlidir.
  6. Sabit oksijen tüketimi 2-5sn sonra, dış mitokondriyal membran (OMM) bütünlüğünü kalite kontrol analizi için, bir 10μL Hamilton mikroenjektör kullanarak 10μM bir final konsantrasyon elde etmek için 4mm sitokrom c 5μL ekleyin.
  7. Sabit oksijen tüketimi 2-5sn sonra, ATP sentaz inhibe 10μL Hamilton mikroenjektör kullanarak, 4 mg / ml oligomycin 1μL ekleyin. Bu titrasyon adım iç mitokondri membran sağlamlık doğrulama sunacak.
  8. Söz konusu modelde Kadıköy değerlendirmenin ardından. Kuru ağırlık veya mitokondriyal işaretleyici belirlenmesi için örnek korunur.
  9. Oxygraph cam odalarından MiR05 çıkarın. Distile su (GKD 2 O) odaları en az üç kez yıkayın.
  10. Odaları gibi oligomycin EtOH çözünen inhibitörleri kaldırmak için% 100 etanol (EtOH) ile en az üç kez yıkayın.
  11. Oxygraph odalarına sterilize etmek için kalıcı 30 dakika yıkayın odaları, final% 70 EtOH ile% 70 EtOH üç kez yıkayın.
  12. Yeni deneysel titrasyon protokol için ek MiR05 önce POS içeren odaları GKD 2 O. ile birlikte en az beş kez yıkanmış sağlamak
  13. Doğrulama titrasyonları, respirometri çalışmaların deneysel ve teşhis amaçları bağlı olarak iyi planlanmış titrasyon protokol içine dahil edilebilir (Şekil 2) tek bir protokol veya titrasyonları olarak yapılabilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 2'de gösterildiği gibi, doğru hazırlanmış bir fare kalp liflerinde oksijen tüketimi, kalite kontrol protokolü tarafından değerlendirilir. Rakamlar 3-5 yanlış hazırlanmış kalp liflerinin sık karşılaşılan örnekler sağlar. Solunum kontrol oranı (RCR) önemli bir respirometri endeksi temsil eder. Bu parametre, oksijen tüketimi ve oksidatif fosforilasyon arasındaki kaplin gösterir. Permeabilize lif hazırlıkları, RCR devlet 4 üzerinden devlet 3 devlet 2 ya da alternatif olarak devlet 3 akrabası oligomycin ve / veya atractyloside, ATR tarafından uyarılan solunum oranıdır. Ayrıca, RCR bir kalite güvence belirteci olarak kullanılan olabilir ve deneysel ya da patolojik müdahaleler ila 5 kaplin değişiklikleri tanımlayabilir. İyi çiftli permeabilize fare kalp hazırlıkları 1 kullanılan kuluçka çözüm, 8, 9 bağlı olarak 3-6 arasında bir RCR verim .

Sitokrom c titrasyonu uygun doku hazırlanması bir doğrulama olarak kullanılır. Sitokrom c mitokondrial iç zarı 10 arası boşlukta bulunan bir protein. Mitokondri dış zarı sağlam olduğunda, endojen sitokrom c arası boşlukta kalır ve eksojen sitokrom c titrasyon solunum ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir (Şekil 2). Mitokondri dış zarı hasar görürse, endojen sitokrom c arası boşlukta serbest ve eksojen sitokrom kadar solunum inhibec ek (Şekil 3). Uygun hazırlıkları% 5-15 aralığı 5 sitokrom c Ayrıca oksijen akı sadece hafif bir yükseklik deneyimine sahip olmaları gerekmektedir. Ayrıca, bu deneysel titrasyon mitokondrial dış membran sağlamlık, patolojik ya da deneysel stres etkisinin değerlendirilmesi için sağlar. Sitokrom c etkisi yaşıyorsanız, doku ve / veya saponin konsantrasyonunu azaltmak mekanik hazırlanması sırasında bakım sağlamak.

Oligomycin ve / veya ATR Ayrıca kaçak solunum değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır; oksijen tüketimi ADP fosforilasyon 11 katkıda değil. Ayrıca, bu titrasyon adımı doğru numune hazırlama bir doğrulama olarak kullanılıyor olabilir. Kontrol veya yabani tip lifler bu ek duyarlı ve oksijen akı önemli bir düşüş deneyimi olmalıdır. Düşük RCR ve nispeten yükselmiş oksijen akı ile sonuçlanan oligomycin ve / veya ATR duyarlılığı azalmış hazırlanması sırasında iç mitokondrial membran (Şekil 4) zarar gösterir. Hasar muhtemelen iç mitokondrial membran dış mitokondrial membran saponin akrabası tarafından hakaret daha az duyarlı olduğu gibi kardiyak liflerin mekanik ayırma sırasında meydana gelir. Ancak, hem mekanik hem de kimyasal hazırlama, yanlış hazırlanmış kalp lifler 5, 12 önlemek için buna göre ayarlanmalıdır olabilir.

Farelerden elde edilen saponin tenli lif demetleri, 2 saat daha fazla fazla 6h veya MiR05 çözüm için RP çözüm kalmamalıdır. Şekil 5 de görüldüğü gibi substrat-inhibitör-uncoupler titrasyonları yanıt eksikliği uzun kuluçka dönemleri göstergesi olabilir. Sonraki çabalar hayvan kurban ve oksijen tüketimi ölçümleri arasındaki dönemlerde en aza indirmek gerekir.

Åžekil 1
Şekil 1 fare kalp lif demetleri Mekanik hazırlanması. A. tüm kalp hemen ardından diseksiyon. B. ön sol ventrikül 10-25mg örnek. C. Kardiyak doku 1mm çap ve 2-4mm uzunluğunda şeritler ayrılır. Saponin ile kimyasal permeabilization hazır D. Nihai kalp lif demetleri.

Åžekil 2
Şekil 2 polarografik değerlendirme yararlanarak uygun doku hazırlanması Temsilcisi sonuçları. Devlet 2 oksijen akı karmaşık I yüzeylerde glutamat ve malat (M / G) tarafından desteklenen ve ADP (devlet 3) yanı sıra önemli ölçüde uyarılır. Eksojen sitokrom c Ayrıca hiçbir uyarıcı etkisi dış mitokondrial membran sağlam olduğunu gösterir. Oksijen tüketimi oligomycin duyarlılığı iç mitokondrial membran bütünlüğünün bozulmamış olduğunu göstermektedir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G, Adenozin difosfat, ADP, Sitokrom c, Cyto c; Oligomycin, o.

Åžekil 3
Şekil 3 polarografik değerlendirme kullanan Sitokrom c etkisi doğrulama testi. Devlet 2 oksijen akı karmaşık I yüzeylerde glutamat ve malat (M / G) tarafından desteklenen ve ADP (devlet 3) yanı sıra önemli ölçüde uyarılır. Eksojen sitokrom c ek uyarıcı etkisi dış mitokondrial membran bütünlüğünde bir bozulma olduğunu gösterir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G Adenozin difosfat, ADP, Sitokrom c, Cyto c.

Åžekil 4
Şekil 4 polarografik değerlendirme kullanan iç mitokondrial membran bütünlüğünü doğrulama testi. Devlet 2 oksijen akı karmaşık I yüzeylerde glutamat ve malat (M / G) ve ADP (devlet 3) Ayrıca, oksijen tüketimi nispeten zayıf stimülasyon tarafından desteklenmektedir. Oligomycin oksijen tüketimi Kötü hassasiyet iç mitokondrial membran hasar olduğunu göstermektedir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G, Adenozin difosfat, ADP Oligomycin, o.

Åžekil 5
Şekil 5 Polarografik değerlendirme MiR05 uzun süreli inkübasyon aşağıdaki. Oksijen tüketimi (ADP Ayrıca aşağıdaki eksojen glutamat ve malat ek (M / G) ve oksijen tüketimi duyarsızstate 3) azalır. Eksojen sitokrom c toplama ve oksijen tüketimi oligomycin duyarsızlık hiçbir uyarıcı etkisi vardır yaşadı. Extramitochondrial inkübasyon çözümü eklemeler yanıt eksikliği mitokondrial fonksiyonel istikrarı tehlikeye göstermektedir. 2 mL kapalı odasında oksijen konsantrasyonu mavi çizgi ile tanımlanır. 2 mL kapalı odasında kalp doku örneği oksijen tüketimi kırmızı çizgi tarafından temsil edilmektedir. Malate ve glutamat, M / G Adenozin difosfat, ADP, Sitokrom c, Cyto c.

1. Notlar: Reaktif Hazırlama
K 2 EGTA 100 mM Stok Çözüm hazırlanması

Reaktifin Adı Final Konsantrasyon (mM) g/100 mL H 2 O
Etilen glikol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) 100 3,805
Potasyum hidroksit (KOH) 200 1,15

Not: oda sıcaklığında pH 7.4 'e ayarlayın.

Ca 2 EGTA 100 mM Stok Çözüm hazırlanması

Reaktifin Adı Final Konsantrasyon (mM) g/100 mL H 2 O Yorumlar (isteğe bağlı)
Etilen glikol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) 100 3,805 Isı 80 ° C ve hafif karıştırın.
Kalsiyum Karbonat (CaCO 3) 100 1,001 Kalsiyum konsantrasyonunu kalsiyum mitokondri de dahil olmak üzere çeşitli organellerin işlevi düzenler gibi hassas olmalıdır. Tüm CaCO 3 tam çözünürleştirme olun. Nihai çözüm tamamen şeffaf olmalıdır. CaCO 3 başlangıçta, karbonik asit ve CO 2 buharlaşma oluşumunu aktive etmek için EGTA ve biraz su ile karıştırılır . Bu reaksiyon, 80 ısınma hızlandırılmış olabilir ° C
Potasyum hidroksit (KOH) 200 1,15 CO 2 buharlaşma tamamlandıktan sonra KOH ile nötralize edin.

Not: oda sıcaklığında pH 7.4 'e ayarlayın.

Gevşeme ve Koruma Çözümü (RP Çözüm) 1 hazırlanması

Reaktif Final Konsantrasyon (mM) Litre başına Yorumlar
K 2 EGTA 7,23 72.3 ml
CAK 2 EGTA 2,77 27.7 ml
Imidazol 20 1.36g
Dithiothreitol 0,5
BoÄŸa 20 2.52g
Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuz hidrat (ATP) 5,7 3.14g
Fosfokreatin (PCr) 14,3 4.0g
Magnezyum klorür (MgCl 2) 6,56 0.624g
K-MES 50 14.0g

Not: oda sıcaklığında pH 7.1 'e ayarlayın.

Mitokondrial respirometri Çözüm Hazırlığı (MiR05 Çözüm) 2

Reaktif Final Konsantrasyon (mM) Litre başına Yorumlar (isteğe bağlı)
Etilen glikol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) 0,5 0.190g Kalsiyum şelasyon olarak kullanılır.
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl 2 .6 H 2 O) 3,0 0.610g Elyaf hazırlama kalitesi, Mg 2 olmadan test + .
Boğa 20,0 2.502g Taurin, bir zar sabitleyici ve antioksidan. 20mm kalp hücre içi konsantrasyonu.
Tekbazlı potasyum fosfat (KH 2 PO 4) 10,0 1.361g
20,0 4.77g
Potasyum-lactobionate 60,0 0.5 M 120 mL
K-lactobionate
hisse senedi 		0,5 M K-lactobionate Stok: 35.83 g lactobionic asit 100 mL H 2 O ve RT 7.0 pH ekleyin. GKD 2 O. ile 200 ml hacim ayarlama Yüksek intrasellüler K + konsantrasyonu çoğaltmak için kullanılır. Daha önce KCl kullanılan, ancak, yüksek mitokondriyal kreatin kinaz fonksiyonu Cl-engeller.
Sakaroz 110,0 37.65g ROS çöpçü olarak kullanılır.
Sığır Serum Albumin (BSA) 1g / L 1g Membran stabilizatör, antioksidan ve serbest yağ asitleri, kalsiyum ve şelasyon olarak kullanılır.

Not: 30 ° C'de pH 7.1 'e ayarlayın.

3. Notlar: Söz konusu modelde Kadıköy Analizi
B. seçin Substratlar, uncouplers ve inhibitörleri

Mitokondrial respirometri Analiz için seçilen Substratlar Listesi

Yüzey [Stok] Hazırlık 2 ml başına hacmi [Final] Yorumlar
Adenozin 5'-difosfat monopotasyum tuz dihidrat (ADP) 500mm 246mg / ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. Saklayınız -80 ° C 250 mcL alikotları. 20ul 5mM Korumak için sürekli Mg 2 + + respirometri deneyler sırasında 0.6 mol MgCl 2 / mol ADP ekleyin.
Askorbat 800mm 0.1584g / ml GKD 2 O. 200 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. Işığa karşı hassastır 5 mcL 2mm Substrat olarak etki TMPD ile paralel olarak kullanılır. Oto-oksidasyon için oksijen akı düzeltmeniz gerekir.
Sitokrom C 4mm 50 mg / ml GKD 2 O. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 5 mcL 10uM
Siyanür Karbonil
p-(trifluoromethoxy)
phenylhydrazone (FCCP) 		0.1mm 0.254mg/10 mL% 100 EtOH. Cam şişe, 500 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 1 mcL Adımlar Bir uncoupler gibi davranır. Maksimum elektron taşıma kapasitesi ve elektron taşıma fosforilasyon sistemi tarafından herhangi bir sınırlama belirler.
Glutamat 2M 0.3742g / ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 10ul 10mM NADH dehidrogenaz için bir substrat görevi görür (karmaşık).
Malate 800mm 0.1073g / ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 5ul 2mm NADH dehidrogenaz için bir substrat görevi görür (karmaşık). Yalnız solunum destek olamaz.
Piruvat 1M 11mg/0.1 ml GKD 2 O. Taze hazırlayın. 5 mcL 2.5mm NADH dehidrogenaz için bir substrat görevi görür (karmaşık).
Succinat 1000mm 1.3505g / 5 ml GKD 2 O. RT pH 7.1 'e ayarlayın. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 20ul 10mM Süksinat dehidrogenaz (karmaşık II) için bir substrat olarak görür.
N, N, N ', N'-tetramethyl
pphenylenediamine
Dihidroklorür (TMPD) 		200mm 47.1mg / ml GKD 2 O. -20 ° C'de 200 mcL alikotları oto-oksidasyon Mağaza önlemek için 10mM son konsantrasyon 0.8M askorbat ekleyin. 5 mcL 0.5mm Mavi renk görünümü belirgin stok solüsyonu oksidasyon. Substrat olarak etki TMPD ile paralel olarak kullanılır. Oto-oksidasyon için oksijen akı düzeltmeniz gerekir.

Mitokondrial respirometri Analiz için seçilen İnhibitörleri Listesi

Yüzey [Stok] Hazırlık 2 ml Odası başına hacmi [Final] Yorumlar
Antimycin A 5mM 27.4mg/10 mL% 100 EtOH. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 1 mcL 2.5μM Koenzim Q: sitokrom c oksidoredüktaz (Kompleks III) inhibitörü </ Td>
Atractyloside 50mm 40 mg / ml GKD 2 O. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 30 mcL 0.75mm ATP sentaz inhibitörüdür.
Oligomycin 4 mg / ml 4 mg / ml% 100 EtOH. 200 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. 1 mcL ATP sentaz inhibitörüdür.
Siyanür Potasyum 1M 65.1mg / ml GKD 2 O. Taze hazırlayın. RT pH 7.1 'e ayarlayın 1 mcL 1mm Sitokrom c oksidaz inhibitörü (karmaşık IV). Aşağıdaki TMPD ve oksidasyon erişmek için Askorbat titrasyon yararlanın.
Rotenone 0.1mm 0.39mg/10 mL% 100 EtOH. 250 mcL alikotları -20 ° C'de saklayın. Işığa karşı hassastır. 1 mcL 0.05μM NADH dehidrogenaz inhibitörü (karmaşık). Ancak, daha yüksek konsantrasyonlarda olarak özetlenen başlamak odasında rotenone tutma azaltmak için gerekli olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Saponin permeabilize kalp fiber tekniği, in vitro ve in vivo olarak değerlendirilmesi mitokondriyal Kadıköy oksijen tüketimi arasında eşsiz bir uzlaşma sunuyor. Bu tekniğin avantajları korunur hücresel mimarisi olarak izole mitokondri göre fizyolojik önemi artan içerir. Plazma zarı bozulmuş olsa da, mitokondri 12 olmak üzere hücre içi membran yapılar, 14, sarkoplazmik retikulum 14, myofilaments ve 1, 17 hücre iskeleti bozulmadan kalır . Ayrıca, mitokondri ve hücre iskeletinin 1, 17 arasındaki etkileşimleri de değişmez. Mitokondri permeabilize lifleri artan kararlılık göstermektedir. Kemirgen lif hazırlıkları 24 saat 18,2 için kararlılık gösteren ve insan 6h lif örnekleri için buz preservations çözümler saklanan olabilir. Mitokondri deneyim inkübasyon çözümü ile hızlı bir şekilde dengeleme. Bu siteye özgü analiz elektron taşıma zinciri eklendi substratı, inhibitörü ve uncouplers 1, 5 yanıt üzerinde doğrudan kontrol sağlar. Ayrıca, yerinde tekniğinde bu doku sadece birkaç miligram gerektirir.

Saponin tenli fiber tekniği sınırlamaları göz ardı edilemez. Kardiyak mitokondri, iki alt popülasyonlar oluşan heterojen. Subsarcolemmal ve interfibriller yerinde mitokondriyal respirometri 5 alt popülasyonlar arasında ayrım yeteneği olmadan mitokondriyal toplam nüfusun değerlendirir. Ayrıca, çeşitli hücresel metabolitleri ve sitozolik faktörler mitokondriyal fonksiyonu düzenler. Bu kalp liflerinin sitozolik bileşenleri, in vivo ortamda 5 tam mitokondriyal değerlendirmek için yetersizlik sonucu permeabilization işlemi sırasında kaybolur .

Raporlama konularda çok önemli bir meseledir. Islak ağırlık veya kuru ağırlık başına oksijen tüketimi ölçümleri ifade edilebilir, ancak, mitokondrial yoğunluk doku kitlesi 7 başına ifade solunum heterojenite akışını önemli bir faktör. Solunum oranları ve referans devlet seçimi büyük ölçüde etkilenmiştir bu yorumu anlamak önemlidir. Söz konusu modelde Kadıköy sonuçları permeabilize lifleri doğrudan karşılaştırmalar için, oranlar, mitokondriyal DNA, sitrat sentaz aktivitesi, sitokrom c oksidaz aktivitesi ve / veya sitokrom aa3 içerik 19 gibi ortak bir referans işaretine göre ifade edilmelidir .

Özetle, respirometri analizi ile birlikte kullanılan permeabilize elyaf hazırlama kalp mitokondri bütünleştirici işlevi değerlendirmesi için olanak sağlar. Çeşitli patolojik ve genetik modellere bu tekniği kullanılır. Bu ilaca bağlı toksisite değerlendirilmesi, yaşlanma, diyabet, konjestif kalp yetmezliği, iskemik hasar ve mitokondriyal fizyoloji 5, 20, oksidatif stres sayılabilir. Saponin-permeabilize fiber tekniği ve polarografik oksijen tüketimi değerlendirmesi çok mükemmel metodolojik yorumlarını ve el yazmaları daha önce yayınlanmış 1, 5, 14, 20 olmuştur ve son derece tavsiye edilir .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Genom Kanada Enstitüsü tarafından desteklendi. JS, Alberta, Kanada Sağlık Araştırma, Kalp ve İnme Vakfı ve Kanada Diyabet Derneği Heritage Vakfı'ndan maaş desteği ödül tutar. Laboratuvar saponin permeabilize fiber tekniği kazanılması sırasında Oroboros Araçların teknik yardım kabul etmek istiyorum.

Materials: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol Fisher Scientific HC600
70% Ethanol Fisher Scientific HC-1000
Adenosine 5€²-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) Sigma-Aldrich A5285
Albumin from bovine serum essentially fatty acid€“free Sigma-Aldrich A-6003
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascobic acid Sigma-Aldrich A4403
Adenosine 5€²-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma-Aldrich A2383
Atractyloside Sigma-Aldrich A6882
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752
Digitonin Sigma-Aldrich D141
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779
Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N€²,N€²-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E4378
Glutamic acid Sigma-Aldrich 27647
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Ketamine Pfizer Pharma GmbH Ketaset
Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M9272
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2ˆ™6H2O) Sigma-Aldrich M9272
Malic acid Sigma-Aldrich M1000
MES Sigma-Aldrich M3671
N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9541
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P5958
Potassium cyanide Fluka 60178
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Sodium Pentobarbital Ceva Sante Animale 1715 138 Conc. 54.7 mg/ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Succinic acid Sigma-Aldrich S3674
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Taurine Sigma-Aldrich T8691
Xylazine Bayer AG Rompun
ddH2O
Ice
Oroboros Oxygraph-2k Oroboros Instruments
Kimwipes VWR international 21905-026
15ml polypropylene centrifuge tubes VWR international 89004-368
50ml polypropylene centrifuge tubes VWR international 89004-364
Straight Jewelers Forceps George Tiemann & Co. 160-50B
Curved Jewelers Forceps George Tiemann & Co. 160-57B
Straight Surgery Scissors George Tiemann & Co. 105-402
Sterile Surgical Blade VWR international BD371610
0.45-µm Syringe filters VWR international CA28145-485
pH meter VWR international CA11388-308
Glass Petri dishes VWR international 89000-300
12-well Polystyrene Tissue Culture Plates VWR international 82050-926
Plate Stirrer VWR international 97042-594
Fisherbrand Microbars Fisher Scientific 14-511-67
Weigh Scale VWR international CA11278-162
10µl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-815-1
25µl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-824-7
50µl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-824-5
Nalgene Squeeze Bottles Wilkem Scientific LNA2407-1000
Polystyrene Weighing Dishes VWR international 89106-750
Dissecting Microscope Olympus Corporation

References: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

  1. Saks, V.A., Veksler, V.I., Kuznetsov, A.V., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem 184 (1-2) : 81-100 (1998).
  2. Gnaiger, E., Kuznetsov, A.V., Schneeberger, S., et al. Mitochondria in the cold. In: Heldmaier G, Klingenspor M, eds. Life in the Cold. X ed: Springer, Berlin, Heidelberg, New York; 431-442 (2000).
  3. Rasmussen, H.N., Rasmussen, U.F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem 319 (1) : 105-113 (2003).
  4. De Visscher, G., Rooker, S., Jorens, P., et al. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma 22 (7) : 793-806 (2005).
  5. Kuznetsov, A.V., Veksler, V., Gellerich, F.N., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc 3 (6) : 965-976 (2008).
  6. Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543:39-55 (2003).
  7. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol 41 (10) : 1837-1845(2009).
  8. Sena, S., Hu, P., Zhang, D., et al. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol 46 (6) : 910-918 (2009).
  9. Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B.T., et al. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation 112 (17) : 2686-2695 (2005).
  10. Lenaz, G., Genova, M.L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal 12 (8) : 961-1008.
  11. Lemieux, H., Hoppel, C.L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr 41 (2) : 99-106 (2009).
  12. Saks, V.A., Vasil'eva, E., Belikova Yu. O., et al. Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta 1144 (2) : 134-148 (1993).
  13. Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. In: Morad M, ed. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. New York: Academic; 307-327 (1978).
  14. Veksler, V.I., Kuznetsov, A.V., Sharov, V.G., et al. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta 892 (2) : 191-196 (1987).
  15. Bangham, A.D., Horne, R.W., Glauert, A.M., et al. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. 196:952-955 (1962).
  16. Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta 822 (1) : 1-42 (1985).
  17. Milner, D.J., Mavroidis, M., Weisleder, N., et al. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol 150 (6) : 1283-1298 (2000).
  18. Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R., et al. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). In: What is Controlling Life? In: Gnaiger E, Gellerich F, Wyss M, eds. Modern Trends in BioThermoKinetics. Vol 3: Innsbruck Univ. Press; 268-271 (1994).
  19. Kuznetsov, A.V., Wiedemann, F.R., Winkler, K., et al. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors 7 (3) : 221-223 (1998).
  20. Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. In: Dykens J, Will Y, eds. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction: John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008)

Ask the Author: Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter