स्लाइस तैयार, Organotypic ऊतक संवर्धन और घड़ी जीन गतिविधि के suprachiasmatic नाभिक में luciferase रिकॉर्डिंग

Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439, doi:10.3791/2439 (2011).

1. समाधान तैयार

1. हवा - बफरिंग क्षमता के साथ संस्कृति मध्यम
   1. लगभग 800 एमएल बाँझ एच ₂ हे (autoclaved milliQ एच ₂ हे) के साथ एक 1 लीटर की बोतल भरें .
   2. जबकि भावप्रवण जोड़ने के लिए, और निम्नलिखित पदार्थों का मिश्रण: 1 कंटेनर कम ग्लूकोज, सोडियम बिकारबोनिट और बिना सीरम मुक्त DMEM 2902 पाउडर phenol लाल (phenol लाल bioluminescence संकेत के साथ हस्तक्षेप), 20 एमएल B27-50x पूरक, एक _7.5% 3 NaHCO की 4.7 एमएल समाधान (या 0.35 छ NaHCO _3), 10 एमएल 1M HEPES, 2.5 एमएल PenStrep 10,000 यू / एमएल और 3.5 जी डी - ग्लूकोज. मध्यम हलचल जब तक सामग्री पूरी तरह भंग कर रहे हैं.
      अंतिम मध्यम (1 लीटर) शामिल होंगे:
      1x DMEM, 1x B27 पूरक, 4.2 मिमी ₃ NaHCO 10 मिमी HEPES, 25 यू / एमएल पेनिसिलिन, 25 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 19 मिमी डी ग्लूकोज.
   3. 7.2 पीएच समायोजित, NaOH कमी या एचसीएल पीएच बढ़ाने के लिए, और मात्रा _लाने बाँझ एच 2 ओ के साथ 1 लीटर के लिए उपयोग
   4. एच ₂ हे (कमी osmolality) या डी ग्लूकोज (वृद्धि osmolality) के साथ osmolality समायोजित करें . osmolality में 285-315 mOsm / किलोग्राम के बीच हो सकता है, लेकिन इष्टतम रेंज में 300-310 mOsm / किलोग्राम है. 5% से अधिक मध्यम पतला नहीं करो.
   5. संस्कृति एक बाँझ हुड में Corning बाँझ वैक्यूम निस्पंदन सेट (जैसे 2 x ताकना आकार 0.22 सुक्ष्ममापी के साथ 500 एमएल) के माध्यम का उपयोग कर फ़िल्टर. 4 ° C में मध्यम रखें और यह एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से रक्षा. हम अनुशंसा करते हैं कि मध्यम 3 महीने के भीतर प्रयोग किया जाता है.
2. हांक संतुलित खुराक के साथ नमक समाधान (HBSS) बफर (काटने स्लाइस के लिए)
   1. ~ 600 एमएल (autoclaved milliQ) बाँझ एच ₂ ओ के साथ एक 1 लीटर कांच की बोतल में भरें और निम्नलिखित पदार्थों का जोड़: 100 एमएल HBSS 10x स्टॉक, 10 एमएल पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन 10,000 / यू एमएल, एक _7.5% NaHCO 3 समाधान के 5 एमएल और 10 एमएल 1M HEPES.
      अंतिम काटने के समाधान में शामिल होंगे:
      1x HBSS, 10 मिमी HEPES, 4.5 मिमी NaHCO _3, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन.
   2. पीएच की जाँच करें और यदि आवश्यक हो, 7.2 पीएच समायोजित और मात्रा लाने बाँझ एच ₂ ओ के साथ 1 लीटर
   3. Osmolality की जाँच करें, जो 285-315 mOsm / किलोग्राम के बीच होना चाहिए.
   4. डिग्री सेल्सियस 4 HBSS कूल HBSS बफर करने के लिए बहुत ठंड टुकड़ा करने की क्रिया / प्रक्रिया काटने के क्रम में करने के लिए नीचे लाने के चयापचय और ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के दौरान (4 ° सी) की जरूरत है.

2. काटना और संवर्धन स्लाइसें से पहले तैयारी

1. ऊतकों सीओ ₂ के बिना एक गर्म सूखी चैम्बर में सुसंस्कृत हैं . बाहर संस्कृतियों सुखाने से बचने के कवर तेल से बर्तन से जुड़ी चश्मे के साथ बंद किया जाना चाहिए. इस प्रयोजन के लिए, सिलिकॉन आधारित वैक्यूम तेल के साथ 5 एमएल सीरिंज भरें. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के छोटे टुकड़ों के साथ सिरिंज सुझावों और उन्हें आटोक्लेव. इसके अलावा, आटोक्लेव फिल्टर कागजात (प्रक्रिया टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान इस्तेमाल किया).
2. राइट प्रक्रिया टुकड़ा करने की क्रिया से पहले, 35 मिमी पेट्री डिश के शीर्ष अंगूठी सतह पर autoclaved वैक्यूम तेल लागू होते हैं. प्रत्येक टुकड़ा संस्कृति के लिए एक अलग पेट्री डिश तैयार है.
3. प्रक्रिया के सभी गैर बाँझ उपकरणों टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करने से पहले, रेज़र ब्लेड, vibratome ब्लेड, कवर चश्मा और अन्य सामग्री टुकड़ा और संस्कृति की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया निष्फल होना चाहिए. 70% इथेनॉल के साथ सभी गैर बाँझ उपकरण स्प्रे. संवर्धन से पहले कम से कम 30 मिनट यूवी जोखिम के लिए उपकरणों और यूवी के साथ एक बाँझ हुड में greased पेट्री डिश बेनकाब.
4. इसी समय, हवा बफरिंग संस्कृति मध्यम (प्रत्येक संस्कृति के लिए 1.2 एमएल गिनती, के लिए 8 संस्कृतियों उदाहरण 10 एमएल मध्यम के लिए तैयार) के साथ एक फाल्कन ट्यूब भरने और हौसले से thawed (0.1 एम शेयर समाधान; Promega, मैडिसन, WI) luciferin जोड़ (10 μL luciferin 10 एमएल मध्यम, अंतिम एकाग्रता 0.1 मिमी).
5. luciferin प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और दोनों स्टॉक समाधान और मध्यम luciferin युक्त प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए. Luciferin मध्यम के साथ एक अंधेरे 36-37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग कक्ष में फाल्कन ट्यूब रखें. यदि उपयुक्त हो, luciferin भी काटने के समय में संस्कृति व्यंजन में सीधे जोड़ा जा. यदि luciferin नहीं जोड़ा जाता है, वहाँ luciferase और luciferin और इसलिए ऊतक से कोई संकेत के बीच कोई प्रकाश प्रतिक्रिया हो जाएगा.
6. यूवी जोखिम के बाद, vibratome के लिए एक बाँझ ब्लेड देते हैं.

3. प्रक्रिया टुकड़ा करने की क्रिया SCN

निम्न कार्यविधि, आमतौर पर 2-4 महीने पुराने, C57/BL6 चूहों वयस्क का टुकड़ा करने की क्रिया का वर्णन करता है. काटने प्रक्रिया, के रूप में अच्छी तरह से रात के दौरान पशुओं के प्रकाश जोखिम के रूप में, विभिन्न SCN के चरण रीसेट कर सकते हैं: कृपया ध्यान दें. इस से बचने के लिए, काटने और संवर्धन प्रकाश घंटे के दौरान प्रदर्शन किया जाना चाहिए, अधिमानतः ZT 6-12 के बीच, जब कोई पर्याप्त चरण प्रक्रिया ^के कारण बदलाव 12 होते हैं. यदि SCN अंधेरे में नमूना हो गया है, 3.1 और 3.2 के लिए लाल बत्ती में या रात काले चश्मे के साथ प्रदर्शन किया जा प्रकाश प्रेरित चरण पाली से बचने है.

1. एक gla में isofluorane (बैक्सटर) द्वारा माउस अधिमानतः anesthetizeएस एस कक्ष. जब जानवर अपने दर्द सजगता (पंजा में नाखून के साथ pinching द्वारा जांच) खो दिया है लेकिन साँस लेने में अभी तक बंद नहीं (ऑक्सीजन की आपूर्ति बनाए रखने के संभव के रूप में लंबे समय के रूप में), तेजी से कैंची या इसी तरह की एक जोड़ी के साथ सिर सिर काटना.
   कृपया ध्यान दें: कुछ देशों में सीओ ₂ जोखिम (hypercapnia) अभी भी चतनाशून्य करनेवाली औषधि पद्धति के रूप में अनुमति दी है, हालांकि यह जानवर चिंता को बढ़ावा देने के लिए सूचित किया गया है. इसके अलावा, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था कत्ल से पहले आवश्यक हो सकता है. स्थानीय विधान का पालन करें जब जानवरों euthanizing.
2. कैंची से सिर से आँखें निकालें तनाव और ऑप्टिक नसों, जो SCN नुकसान पहुंचा सकता है की आगे की उत्तेजना को रोकने के क्रम में.
3. यदि अभी भी जुड़ी है, कैंची के साथ पिछले गर्भाशय ग्रीवा हड्डीवाला निकालने के लिए, त्वचा (चित्र 1a) को हटाने और कैंची (उदाहरण परितारिका कैंची के लिए) के ठीक एक जोड़ी के साथ दो कटौती, पक्षों के साथ खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष पर एक कट बनाने के लिए, इस प्रकार बनाने एक हटाने योग्य "ढक्कन".
4. एक माइक्रो rongeur उपकरण (ठीक विदारक कैंची भी एक चूहे पर इस्तेमाल किया जा सकता है) के साथ खोपड़ी खोलें और सभी हड्डी को हटाने तक घ्राण बल्ब देखा जा सकता है है. कार्य ऊपर दबाने, मस्तिष्क कभी नीचे उपकरण के साथ, वेंट्रल SCN (चित्र 1b) के नुकसान को रोकने के क्रम में.
5. ध्यान से घ्राण बल्ब और ठीक वसंत कैंची विदारक सूक्ष्म का उपयोग गोलार्द्धों के बीच ऑप्टिक तंत्रिका काटा. यकीन है कि तंत्रिका पूरी तरह से ऑप्टिक तंत्रिका खींच के बाद से SCN और उठी स्लाइस में नुकसान हो सकता है काट रहा है.
6. सिर उल्टा मुड़ें और दो बरकरार मस्तिष्क कंटेनर (उदाहरण के लिए एक गिलास पेट्री डिश ≈ 10 सेमी) के साथ भर में बाहर गिर (अगर अभी भी मस्तिष्क से जुड़ी अन्य कपाल नसों को ऑप्टिक तंत्रिका दुम कटौती हो की आवश्यकता हो सकती है) 50-100 एमएल ठंड HBSS मस्तिष्क के तेजी से ठंडा की अनुमति. आदर्श रूप में, दो ऑप्टिक नसों बरकरार रहना चाहिए (चित्र -1 सी). HBSS 30-60 सेकंड में मस्तिष्क रखें यकीन है कि मस्तिष्क ठंडा है बनाना.
7. एक चम्मच या इसी तरह का प्रयोग करें और ठंडा मस्तिष्क, पृष्ठीय सतह जगह है, एक बाँझ काटने की सतह पर (उदाहरण के लिए एक गिलास पेट्री डिश ढक्कन बदल उल्टा). आदेश में राज्याभिषेक कटौती को तैयार करने के लिए, बाँझ रेजर ब्लेड या नलियां प्रमस्तिष्क गोलार्द्धों और सेरिबैलम के बीच के साथ एक सीधा कटौती करने के लिए, इस प्रकार सेरिबैलम हटाने.
8. सूखी vibroslicer / vibratome संबंधित मंच पर superglue लागू करें.
9. व्याख्यान चबूतरे वाला भाग में एक तेज, घुमावदार संदंश डालने से मस्तिष्क (सेरिबैलम के बिना और घ्राण बल्ब के बिना मस्तिष्क गोलार्द्धों) उठाओ और ध्यान से एक बाँझ फिल्टर पेपर पर बंद HBSS सूखी, अभी भी संदंश के साथ मस्तिष्क पकड़े. (एक संदंश डालने के बजाय, बाँझ फिल्टर पेपर का एक छोटा सा टुकड़ा को देते हैं और मस्तिष्क को हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है).
10. व्याख्यान चबूतरे वाला टिप ऊपर और उदर ब्लेड काटने के लिए निकटतम सतह के साथ चिपके मंच पर गोलार्द्धों को ठीक करें. Vibratome (Campden उपकरण, ब्रिटेन से उदाहरण के लिए) से संबंधित धारक में मंच संलग्न और तुरंत यह ठंड HBSS के साथ भरने. यदि सीधा कटौती ठीक से किया जाता है, गोलार्द्धों सीधे इस प्रकार एक अच्छा कोण एक राज्याभिषेक द्विपक्षीय SCN युक्त कटौती बनाने के लिए आवश्यक प्रदान के ऊपर खड़े हो जाना चाहिए.
11. आदेश में लक्ष्य SCN क्षेत्र तक पहुँचने के लिए, vibratome के उच्च या अधिकतम गति पर बंद गोलार्द्धों के मोटा वर्गों (500-800 सुक्ष्ममापी) में कटौती शुरू करते हैं. चलती ब्लेड काफी जल्दी शुरुआत में hypothalamus तक पहुँचने से पहले, लेकिन किया जा सकता है धीमा किया जाना चाहिए जब ऑप्टिक chiasm दिखाई हो जाता है (हिल ब्लेड और धीमी गति के उच्च आवृत्ति क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान कोशिका क्षति कम हो जाती है, इस प्रकार टुकड़ा व्यवहार्यता बढ़ रही है). 100 सुक्ष्ममापी जब ऑप्टिक chiasm बड़ा हो जाता है (व्यापक) और पूर्वकाल commissure छोटा हो जाता है के लिए वर्गों कम. आदेश में एक मध्य SCN अनुभाग को प्राप्त करने के लिए, अपने आप को "नीचे" (दुम दिशा) काम जब तक दो SCN नाभिक को दिखाई शुरू. एक आवर्धक कांच नाभिक को दृश्यमान करने के लिए आवश्यक हो सकता है. कृपया ध्यान दें: माउस मस्तिष्क में SCN ऑप्टिक chiasm की दुम स्थित है चूहा मस्तिष्क के रूप में की तुलना में.
12. जब SCN के वांछित स्तर तक पहुँच गया है (SCN इस बिंदु पर प्रकट होगा, के रूप में और अधिक परिभाषित गोल या बादाम के आकार का संरचनाओं, अंजीर 1d, लगभग Bregma - 0.46 -0.70 ¹³ माउस, Bregma में SCN के केंद्र क्षेत्र के लिए मिमी - चूहे के लिए ¹⁴ मिमी 0.92 -1.40), SCN अनुभाग (चित्र 1e) में कटौती . चूहे 350 ± 50 सुक्ष्ममापी के लिए, टुकड़ा के उपयुक्त मोटाई 250 ± 50 सुक्ष्ममापी माउस के लिए है.
13. एक नरम ब्रश का उपयोग लिफ्ट और एक ढक्कन के लिए एक मध्यम आकार पेट्री ठंड HBSS से भरा पकवान, एक विच्छेदन खुर्दबीन या स्टिरियोस्कोप के तहत रखा से SCN टुकड़ा हस्तांतरण. आवर्धन के तहत की जाँच करें अगर द्विपक्षीय SCN स्पष्ट रूप से दिखाई देता है. यदि SCN के मध्य क्षेत्र चुना जाएगा (जो जरूरी केवल "इष्टतम" टुकड़ा स्तर नहीं हो सकता है लेकिन हम पर विचार के लिए टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया मानकीकरण और भिन्नता को कम करने का सबसे आसान तरीका है कि हो सकता है), यह स्पष्ट रूप से कम से कम पर देखा जाना चाहिए के एक तरफटुकड़ा अनुभाग. अगर कटौती भी व्याख्यान चबूतरे वाला था, दूसरे खंड बनाने के लिए और बढ़ाई तहत SCN के लिए जाँच करें.

4. Organotypic SCN संस्कृति

1. पेट्री डिश HBSS के साथ भरा ढक्कन, एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत बाँझ नलियां की एक जोड़ी के साथ एक वर्ग ऊतक (~ 1.5 मिमी प्रत्येक पक्ष) के रूप में द्विपक्षीय SCN टुकड़े करना. ऑप्टिक chiasm का एक छोटा सा टुकड़ा explant के लिए जुड़ा रहेगा, लेकिन कोई अन्य नाभिक शामिल किया जाना चाहिए. SCN ऊतक को हटाने के बिना कट के रूप में बंद के रूप में संभव है.
2. यदि योजना बनाई प्रयोग के लिए उपयुक्त है, द्विपक्षीय SCN तो आधे में कटौती कर सकते हैं दो एकतरफा SCN प्राप्त है. एक एकतरफा SCN तब नियंत्रण (2a चित्र) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. 35 ≈ मिमी पेट्री डिश में luciferin माध्यम से 1200 μL भरें और तरल सतह (2b) के शीर्ष पर एक संस्कृति झिल्ली (मिल्ली - मुख्यमंत्री 0.4 सुक्ष्ममापी, Millipore, Bedford, MA) जगह. संस्कृति मध्यम मात्रा महत्वपूर्ण है, संस्कृति झिल्ली के रूप में सुरक्षित पकवान संस्कृति के आधार पर बैठने नाव ^या मध्यम 11 में रॉक नहीं करना चाहिए ,. सुनिश्चित करें कि वहाँ झिल्ली के तहत कोई हवाई बुलबुले हैं. जब luciferin के साथ काम कर रहे अनावश्यक प्रकाश जोखिम से बचें.
4. explants छोटे और लेने के लिए मुश्किल हैं. इसलिए एक 1000 μL + टिप में SCN explant चूसना और यह झिल्ली पर बाहर प्रेस टिप पिपेट का उपयोग करें. टिप एक बाँझ के लिए एक व्यापक खोलने बनाने के उपकरण के साथ काटा जा सकता है है, मामले में explant भी आसानी से एक 1000 μL विंदुक टिप (और माउस द्विपक्षीय SCN जैसे चूहे SCN) में फिट बड़ा है. विंदुक के साथ झिल्ली पर अत्यधिक HBSS त्यागें. Luciferase रिकॉर्डिंग के लिए, केवल एक SCN / पकवान (चित्र 2b) जगह के रूप में रिकॉर्डिंग ट्यूबों सभी पकवान से उत्सर्जित फोटॉनों का पता लगाने और विभिन्न ऊतकों से संकेतों के बीच भेद नहीं है.
5. एक कवर ग्लास (≈ 40 मिमी, मेंजेल Glaser, जर्मनी) और वैक्यूम (डॉव Corning कॉर्प, संयुक्त राज्य अमरीका) तेल ¹¹ के साथ पकवान सील . सुनिश्चित करें कि मुहर तंग (चित्र 2c). यदि नहीं, तो अधिक तेल के साथ सील.
6. एक 36-37 डिग्री सेल्सियस प्रकाश तंग कक्ष व्यंजन स्थानांतरण और PMT रिकॉर्डिंग तुरंत शुरू.

5. Luciferase गतिविधि की रिकॉर्डिंग bioluminescence द्वारा मापन

Luciferase छोटे SCN के ऊतकों से प्रेरित bioluminescence संकेतों का पता चला और photonmultiplier ट्यूब (PMT) डिटेक्टर एक प्रकाश तंग कक्ष के अंदर घुड़सवार विधानसभाओं के साथ प्रवर्धित. PMTs सामान्य संस्कृति ⁸ व्यंजन ऊपर ~ 1-2 सेमी तैनात हैं. PMT रिकॉर्डिंग setups के कस्टम बनाया या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ¹¹ किया जा सकता है.

1. PMT (PMT से उत्पादित गर्मी कांच कवर पर संक्षेपण निकाल देंगे) के तहत पकवान प्लेस और चैम्बर बंद. सुनिश्चित करें कि कक्ष 100% SCN ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया PMTs के अंधेरे गिनती के रूप में प्रकाश तंग बहुत कम है (कम से कम 20 फोटॉनों / मिनट). PMTs भी कमजोर प्रकाश रिसाव का पता लगाने.
2. डाटा अधिग्रहण, जो सॉफ्टवेयर (; Actimetrics इंक, Wilmette, आईएल, संयुक्त राज्य अमेरिका उदाहरण LumiCycle के लिए) के साथ किया जाता है शुरू करो. अभिव्यक्ति / जीन प्रोटीन की उच्च संकल्प मिल फोटॉन गिनती 1-10 मिनट के अंतराल पर एकीकृत कर रहे हैं.
3. ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics इंक, Chrono Roenneberg तक, विश्वविद्यालय के म्यूनिख, रिकॉर्डिंग के बाद समाप्त हो गया है, प्राप्त जीन / प्रोटीन के circadian अभिव्यक्ति उपयुक्त सॉफ्टवेयर (उत्पत्ति, OriginLab, नॉर्थम्प्टन, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका के साथ विश्लेषण किया जा सकता है म्यूनिख, जर्मनी) चरण, अवधि (एक चक्र के लिए समय) और ताल के आयाम निर्धारित करने के लिए. जीन या प्रोटीन के शिखर अभिव्यक्ति ज्यादातर संदर्भ बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है और एक चक्र के दौरान उच्चतम फोटॉन गिनती के रूप में परिभाषित किया है. डेटा चरण की अवधि, और आयाम के विश्लेषण से पहले smoothed जा सकता है, खासकर अगर संकेत / शोर अनुपात कम है. आधारभूत कभी कभी परिवर्तन है और पहले विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं घटाया की जरूरत है.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

हम यहाँ मौजूद oscillatory PER2: ल्यूक अभिव्यक्ति के रूप में एक सुसंस्कृत ऊतक की व्यवहार्यता और हालत के लिए बाहर पढ़ने. इष्टतम स्थितियों के तहत, और अगर जीवित ऊतक, PER2 है: ल्यूक अभिव्यक्ति एक circadian ताल के साथ oscillates आंकड़ा 3 में दिखाया गया है के रूप में. PER2 SCN में ज़्यादा से ज़्यादा Zeitgeber 12-13 समय (: चक्र अंधेरे जहां 12 ZT रोशनी 12:12 घंटा प्रकाश में बंद का प्रतिनिधित्व करता है है) के चारों ओर आम तौर पर व्यक्त की. आकार में बड़ा जीना ऊतक है, उच्च फोटॉन गिनती हो जाता है. हालांकि, और organotypically सुसंस्कृत ऊतक के आकार और मोटाई छोटे रखा जाना चाहिए क्रम में करने के लिए ऊतक व्यवहार्य, ^{15 11 2} मिमी से भी बड़ा और मोटा तुलना ^में 7 500 सुक्ष्ममापी नहीं नहीं अधिमानतः रखने . SCN, अगर dissected के रूप में यहाँ वर्णित है, आम तौर पर 10.000-40.000/min बीच फोटोन मायने रखता है पता चलता है अगर ऊतक एक homozygous PER2 से नमूना है: ल्यूक जानवर. organotypic SCN संस्कृतियों में दोलन के आयाम आम तौर पर बहुत पहले चक्र के दौरान उच्च के रूप में निम्नलिखित चक्र के साथ तुलना. यह पूरी तरह स्पष्ट नहीं है क्यों पहले चक्र बहुत ही उच्च amplitUde. एक संभावित व्याख्या यह है कि ऊतकों में कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा प्रारंभिक काटने और संवर्धन के बाद शीघ्र ही मर जाते हैं, पहले चक्र के बाद इस प्रकार नहीं luciferin उपयोग कर सकते हैं. काटने प्रक्रिया भी अत्यधिक उत्तेजना है, जो पहले चक्र के दौरान luciferase संकेत बढ़ाना सकता है कारण हो सकता है.

चित्रा 3 SCN स्लाइस से luminescence निशान से पता चलता है और एक का पता लगाने (लाल) एक टुकड़ा है कि शुरू में स्वस्थ नहीं था से प्राप्त होता है. मृत या अस्वस्थ ऊतकों कम फोटान गणना baselines है. (इसके अलावा, मृत ऊतकों अक्सर पकवान में अलग कर देना और एक टुकड़ा में झिल्ली से नहीं हटाया जा सकता है.)

इस रिपोर्ट में वर्णित तकनीक लाभदायक औषधीय प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 4 में एक संस्कृति है कि हम एक HCN चैनल अवरोधक (ZD7288, 10 सुक्ष्ममापी) के साथ इलाज के दिन 1 और 2 के बीच से एक निशान से पता चलता है. जैसा कि आकृति में देखा जा सकता है और के ^रूप में 15 पहले प्रकाशित, अवरोधक काफी PER2 के circadian दोलन के आयाम को कम है, तथापि, दोलन सामान्य मध्यम संस्कृति के साथ बाहर धोने के बाद वापस आ गया, प्रदर्शन है कि अवरोधक आणविक घड़ी प्रभावित लेकिन व्यवहार्य और स्वस्थ ऊतक था.

चित्रा 1. प्रक्रिया टुकड़ा करने की क्रिया
ए) आंखों और त्वचा के साथ एक euthanized decapitated माउस के सिर हटा दिया. बी) खोपड़ी एक माइक्रो rongeur उपकरण के साथ हटा दिया जाता है. जब उपकरण का उपयोग, एक ऊपर की ओर काम करते हैं और मस्तिष्क दबाएँ कभी नीचे सी) उपकरण के साथ मस्तिष्क उल्टा घ्राण बल्ब के बिना (ventral तरफ ऊपर) से पता चला.. दो बरकरार ऑप्टिक नसों के साथ सफेद ऑप्टिक chiasm देखा जा सकता है. suprachiasmatic नाभिक (SCN, लाल रंग से चिह्नित सीमाओं) ऑप्टिक chiasm के पास स्थित है). डी coronally कटौती vibroslicer में SCN के स्तर पर मंच के लिए, संलग्न मस्तिष्क.) ई कोरोनल मस्तिष्क अनुभाग (250 सुक्ष्ममापी मोटी) ऑप्टिक chiasm (OC), तृतीय (3V) निलय और द्विपक्षीय suprachiasmatic नाभिक (SCN) युक्त.

चित्रा 2. Organotypic ऊतक संवर्धन.
ए) दो एकतरफा SCN नाभिक (डालने) टुकड़ा से dissected दिखाया बी) संस्कृति झिल्ली, मध्यम और explant वैक्यूम तेल और कांच कवर के बिना, लेकिन साथ संस्कृति पकवान (35 मिमी पेट्री डिश ). मध्यम (1.2 एमएल) पकवान और झिल्ली के बीच तरल के रूप में देखा जा सकता है है. एक एकतरफा SCN नाभिक संस्कृति झिल्ली पर रखा है. छोटे ऊतक के whitest हिस्सा ऑप्टिक chiasm (डालने) का एक टुकड़ा है, सी) संस्कृति पकवान, अपनी झिल्ली और उसके SCN ऊतक के साथ वैक्यूम तेल और एक गोल कांच कवर के साथ बंद.

चित्रा 3. स्वस्थ और गैर स्वस्थ SCN ऊतक संस्कृतियों से bioluminescence रिकॉर्डिंग.
PERIOD2 के bioluminescence रिकॉर्डिंग के उदाहरण: luciferase (PER2:: ल्यूक) suprachiasmatic नाभिक में अभिव्यक्ति (SCN) 12h में आयोजित चूहों से प्राप्त स्लाइस: 12h प्रकाश: अंधेरे चक्र. PER2: ल्यूक प्रोटीन एक circadian (~ 24 घंटा) भिन्नता है जिसमें प्रोटीन की अधिकतम अभिव्यक्ति Zeitgeber 12-13 समय पर होता है के साथ झूल रहे हैं. इस प्रकार, जीन ताल के चरण प्रकाश अंधेरे अनुसूची में जो जानवर पहले बलिदान रखा गया था पर निर्भर है. आमतौर पर, एकतरफा SCN प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में dissected ऊतकों से bioluminescence 10.000-40.000/minute ~ के बीच फोटोन मायने रखता है दिखाता है. आंकड़ा एक स्वस्थ (काला) SCN संस्कृति, एक गैर स्वस्थ SCN (लाल) संस्कृति और एक SCN संस्कृति है कि बाहर सूख (नीला) 4 दिन में सील संस्कृति डिश खोलने के बाद और पकवान नहीं ठीक से फिर से सील से निशान से पता चलता है ( तीर द्वारा संकेत).

चित्रा 4. दवा जोखिम के दौरान और बाद में bioluminescence रिकॉर्डिंग .
PER2: एक संस्कृति में पहले के दौरान, और एक HCN चैनल अवरोधक (ZD7288, 10 सुक्ष्ममापी) की कार्रवाई के बाद ल्यूक अभिव्यक्ति. पहला तीर समय है जब अवरोधक जोड़ा गया है इंगित करता है. दूसरा तीर वार्शआउट, जो वातानुकूलित नियंत्रण के माध्यम से मध्यम युक्त दवा की जगह द्वारा बनाया गया था इंगित करता है. दवा जोखिम, 4 दिन में दोलन की कमी और वार्शआउट के बाद प्रोटीन ताल के जल्दी ठीक होने के 2 दिनों के बाद कम आयाम ध्यान दें.

Luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी के साथ लाभ और नुकसान

RT-पीसीआर के रूप में पूर्व vivo तरीकों,, स्वस्थानी संकरण और पश्चिमी धब्बा है कि कई अलग अलग समय अंक (सामान्य 2-4 बजे के नमूना आवृत्ति के आधार पर एक कम समय संकल्प देने) में ऊतक के नमूने की आवश्यकता है क्रम में प्रतिदिन अध्ययन के विपरीत जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में बदलाव, luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी उच्च (1-10 मिनट) संकल्प ही तैयारी में कई दिनों के लिए circadian दोलनों के अध्ययन की अनुमति देता है. चरण और ताल की अवधि पर प्रभाव के इस प्रकार, प्रयुक्त जानवर की संख्या कम से कम है और विस्तृत अध्ययन संभव है, जो आम तौर पर संभव नहीं है कम समय संकल्प के साथ पारंपरिक नमूना तकनीक का उपयोग कर. हालांकि, हालांकि लय के सापेक्ष आयाम माप संभव हो रहे हैं, यह जोर दिया जाना चाहिए कि रिपोर्टर प्रौद्योगिकी मात्रात्मक नहीं है और इसलिए इस्तेमाल किया जा सकता है नहीं करने के लिए लिखित जीन या अनुवादित प्रोटीन की मात्रा को मापने के.

ऊतक रिकॉर्डिंग और संवर्धन, सीधे vivo में प्रकाश प्रेरित चरण पाली आदि में vivo में तनाव की आणविक प्रभाव, अध्ययन के लिए एक महान लाभ के बाद तुरंत शुरू किया जा सकता विश्लेषण organotypic SCN संस्कृति लंबी अवधि (सप्ताह) वयस्क मस्तिष्क के औषधीय हेरफेर की अनुमति देता है एक अक्षुण्ण परिपक्व synaptic नेटवर्क और luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी युक्त ऊतक कई सप्ताह के लिए स्थिर रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है. इस प्रकार, ऊतक नवजात या जल्दी प्रसवोत्तर क्रम में स्वस्थ संस्कृतियों प्राप्त करने की जरूरत नहीं करता है और तीव्र टुकड़ा पुरानी औषधीय उपचार के विपरीत किया जा सकता है है. सेल संस्कृतियों में प्लाज्मिड संवाददाता transfections, जो कोई डीएनए के जीनोम में शामिल करने के लिए नेतृत्व करने के लिए इसके विपरीत में, ट्रांसजेनिक luciferase पशु मॉडल (के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lenti-वायरस transfections) अनुकूल हैं अगर epigenetic परिवर्तन के लिए अध्ययन किया जा रहे हैं. इस संदर्भ में यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि luminescence इमेजिंग आजकल बेहद संवेदनशील सीसीडी ¹¹ कैमरों के साथ संभव है, एकल SCN न्यूरॉन्स (~ 6-10 सुक्ष्ममापी) और अन्य प्रकार की कोशिकाओं, प्रमुख circadian लय अध्ययन प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में भी रिकॉर्डिंग की अनुमति है. अंत में, कई circadian जांचकर्ताओं आमतौर पर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे अन्य संवाददाताओं, का उपयोग करने के क्रम में घड़ी ^जीन / प्रोटीन 16-19 दोलनों अध्ययन आणविक अभिव्यक्ति की निगरानी का उपयोग करें.

टुकड़ा मोटाई के पहलुओं

SCN टुकड़ा (200-300 सुक्ष्ममापी) के यहाँ की सिफारिश की thicknesses या कम किया जा सकता वृद्धि हुई है अगर वांछित. हालांकि, हालांकि ऊतक झिल्ली पर संस्कृति में कुछ दिनों के बाद बाहर दुबला बना देती है है, यह शुरू में कटौती टुकड़ा की 500 सुक्ष्ममापी मोटाई से अधिक के ^क्रम में 7 ऊतक की व्यवहार्यता की रक्षा की सिफारिश नहीं है. एक टुकड़ा 100 सुक्ष्ममापी की तुलना में पतली यांत्रिक और व्यावहारिक कारणों को संभालना मुश्किल है. क्योंकि SCN ऊतक विषम है टुकड़ा की मोटाई luciferase उत्पादन में संकेत के चरण को प्रभावित कर सकता है के बाद से, SCN है (उदाहरण के लिए "खोल", और पृष्ठीय बनाम वेंट्रल क्षेत्रों बनाम "कोर") के भीतर विभिन्न क्षेत्रों के विभिन्न चरणों के साथ थरथराना ²⁰ और विभिन्न चरण के बाद फिर से सिंक्रनाइज़ ²¹ बदलाव है . स्लाइस की मोटाई भी फोटान गणना के आधारभूत को प्रभावित करता है के बाद से अधिक ऊतक फोटॉनों की एक बड़ी संख्या उत्सर्जन करता है. आणविक दोलनों के आयाम इस तरह परोक्ष रूप से explant के आकार से प्रभावित हो सकता है. इन कारणों के लिए, नियंत्रण और इलाज संस्कृतियों हमेशा एक ही आकार, मोटाई, और चाहिए क्रम में करने के लिए एक ही चरण में और एक ही आयाम के साथ थरथराना SCN के एक ही क्षेत्र युक्त. दो एकतरफा नाभिक, दूसरे हाथ पर, चरण में एक दूसरे के साथ और लंबे समय के रूप में इसी तरह के आयाम के साथ थरथराना vibratome कटौती के रूप में क्षैतिज और (जो बारी में है कि सेरिबैलम और दो गोलार्द्धों के बीच कटौती जुदाई सीधा है पर निर्भर है angled नहीं है मेज की सतह के लिए). एक अन्वेषक जो SCN संवर्धन करता अनुभव हो सकता है कि SCN संस्कृतियों चरण में एक दूसरे के साथ नहीं थरथराना है. अभ्यास और टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक के मानकीकरण यानी, स्लाइस हमेशा SCN rostro - दुम के समान स्तर पर काट रहे हैं, परिणाम में सुधार होगा.

महत्वपूर्ण कदम

1. आक्सीजन की आपूर्ति महत्वपूर्ण है.
   क्योंकि मस्तिष्क ²² ऑक्सीजन का एक बहुत आवश्यकता है, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया करने के लिए जल्दी की जरूरत है (3.1-3.10 करीब ~ 5-6 मिनट के लिए बेहतर है यह क्रम में ऊतकों को स्वस्थ रखने के है ).
2. SCN तापमान परिवर्तन और मध्यम मुद्रा के प्रति संवेदनशील है.
   SCN तापमान संवेदनशील है और बड़े तापमान में परिवर्तन चरण पेसमेकर बदलाव कर सकते हैं और प्रयोगात्मक कलाकृतियों के कारण ^23. यदि मध्यम या समाधान का आदान - प्रदान कर रहे हैं या उदाहरण के लिए चल रहे एक प्रयोग है, जब संस्कृति में दिन के एक जोड़े के बाद एक दवा को लागू करने, मध्यम या solutio के दौरान जोड़ाn पूर्व गर्म 36-37 के लिए डिग्री सेल्सियस (चैम्बर में के रूप में एक ही तापमान) से पहले इसके अलावा हो की जरूरत है. औषधीय प्रयोगों है कि मध्यम एक्सचेंजों को शामिल में, यह हमेशा पूर्व वातानुकूलित सेल संस्कृति माध्यम के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. जोड़ / ताजा के साथ बाहर धोने, असुविधाजनक मध्यम संभावित आणविक SCN ²⁴ ताल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य कोशिका प्रकार ²⁵ संस्कृतियों बदलाव चरण कर सकते हैं.
3. मध्यम रचना.
   यह सही पीएच और osmolality में टिशू कल्चर के लिए महत्वपूर्ण है. मध्यम हवा - बफरिंग HEPES की एक बड़ी राशि है, जो एक इष्टतम पीएच 6.8-8.2 की रेंज में बफर क्षमता है और पीएच परिवर्तन है कि सेल श्वसन का एक परिणाम के के रूप में हो सकता है बफरन के लिए भी उपयुक्त है शामिल हैं. HEPES, दूसरे हाथ पर, अधिक तापमान के रूप में सोडियम बिकारबोनिट, जो संस्कृति के माध्यम में छोटी मात्रा में शामिल है के साथ तुलना में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है. सोडियम बिकारबोनिट कम पीएच (5.1-7.1) ²⁶ रेंज, इस तरह सीओ ₂ के वातावरण में उपयुक्त में एक बड़ा बफरिंग क्षमता है . हालांकि, हवा बफरिंग मध्यम (2902 DMEM) में सोडियम बिकारबोनिट की मात्रा में वृद्धि हुई osmolality काफी बढ़ जाती है और साथ ही मध्यम, जो अमीनो एसिड, विटामिन, और आयनों के गलत संरचना में बारी परिणामों में. गिराए बिना नहीं कर सकते हैं जोड़ा है
   मध्यम तैयारी के लिए सलाह:
   1. सटीक और सावधान रहो, जब मध्यम मिश्रण.
   2. केवल ताजा या हौसले से thawed शेयर समाधान का उपयोग करें.
   3. बहुत ही उच्च osmolality के मामले में यह गिराए लायक नहीं है. 5-6% से अधिक पतला मध्यम सबसे अधिक संभावना काम नहीं करेगा. D शर्करा का प्रयोग osmolality वृद्धि अगर यह बहुत कम है.
4. चरण तैयारी के समय के कारण बदलाव
   टुकड़ा की तैयारी के समय महत्वपूर्ण है. चरण पर शून्य या न्यूनतम प्रभाव अगर टुकड़ा प्रक्रिया ZT 6-12 ¹² के बीच किया जाता है प्राप्त की है. सभी टुकड़ा dissections प्रतिदिन या circadian चक्र का एक ही चरण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्रम में के लिए तैयारी के बीच भिन्नता चरण की वजह से त्रुटि कम से कम.

संभावित संशोधनों

1. बफर, टुकड़ा करने की क्रिया शुरू होने से पहले ऑक्सीजन (95% ₂ हे, 5% सीओ ₂₎ के साथ संतृप्त, तीव्र SCN इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए टुकड़ा करने की क्रिया (ACSF कृत्रिम Cerebro स्पाइनल द्रव) घंटी के साथ प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, ऑक्सीजन लगातार बफर करने के लिए पूरे टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान जोड़ा, बिजली और synaptic गतिविधि के रूप में ^सीधे ऑक्सीजन की आपूर्ति 22 पर निर्भर है की जरूरत है.
2. क्षैतिज और बाण के समान स्लाइस भी सफलतापूर्वक तैयार किया जा सकता है और SCN के सुसंस्कृत. लेखकों क्षैतिज स्लाइस में luciferase रिकॉर्डिंग है, जो हमारे अनुभव के अनुसार कम आयाम के साथ circadian दोलनों देने के रूप में राज्याभिषेक कटौती के साथ तुलना के साथ अनुभव है.
3. SCN लगभग 1 मिमी लंबे rostro caudally है और टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक यहाँ वर्णित मध्य क्षेत्र में एक SCN अनुभाग प्राप्त करने की ओर लक्षित है. हालांकि, एक से अधिक SCN अनुभाग माउस और चूहे के दिमाग से प्राप्त किया जा सकता है, SCN नाभिक के अधिक व्याख्यान चबूतरे वाला बनाम दुम स्तर पर circadian अभिव्यक्ति / जीन प्रोटीन की जांच की अनुमति.
4. स्लाइस संस्कृतियों, छोटे जानवरों, प्रसवोत्तर पिल्ले या यहाँ तक कि भ्रूण से भी तैयार किया जा सकता है. कृपया ध्यान दें कि खोपड़ी और बहुत छोटे पिल्ले में मस्तिष्क बहुत नरम और संवेदनशील हैं. इसके अलावा, ऑप्टिक तंत्रिका पतली और पूरी तरह से विकसित नहीं है. सावधानी जब पिल्ले के मस्तिष्क विदारक SCN क्षेत्र इतना है कि क्षतिग्रस्त नहीं है ले लो. उदाहरण के लिए, माइक्रो rongeur उपकरण माउस पिल्ले की खोपड़ी खोलने का उपयोग नहीं किया क्योंकि वे बहुत बड़े हैं कर सकते हैं. ठीक कैंची युवा पिल्ले में मुलायम ऊतकों में कटौती करने के लिए पर्याप्त हैं.
5. कवर कांच आधारित संस्कृति यहाँ वर्णित तकनीक भी छवि एक सीसीडी / EM-सीसीडी कैमरा का उपयोग करते हुए एकल SCN न्यूरॉन्स में भी luminescence के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
6. अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र क्षेत्रों और ट्रांसजेनिक PER2 से परिधीय अंग के ऊतकों: ल्यूक जानवरों को आसानी से प्राप्त किया जा सकता है सभ्य और आणविक दोलनों के संदर्भ में विश्लेषण के रूप में PER2: ल्यूक अभिव्यक्ति के लिए कई दिनों के लिए अन्य ऊतकों की एक संख्या में भी थरथराना जारी और सेल ¹⁰ प्रकार के. इन परिधि के ऊतकों में से अधिकांश, उदाहरण जिगर के लिए, अस्तित्व के लिए एक झिल्ली की आवश्यकता नहीं है, लेकिन बजाय सीधे ^{मध्यम} 11 में नहाया सुसंस्कृत . कृपया ध्यान दें कि सेक्शनिंग करने के लिए कारण स्थानांतरण चरण, संवर्धन और मध्यम विनिमय SCN के लिए के रूप में एक ही सिद्धांतों का पालन नहीं हो सकता है.

महत्व

ट्रांसजेनिक माउस और चूहा उपभेदों (mPER2: ल्यूक, mPer1 ⁸ - ^{ल्यूक, 10, 27)} में luciferase एंजाइम गतिविधि प्रोटीन या जीन की अभिव्यक्ति की लय को दर्शाता है और bioluminescence रिकॉर्डिंग के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. bioluminescence luciferase उत्पन्न एक कमजोर संकेत देता है, लेकिन पृष्ठभूमि luminescence शून्य के करीब है, इस विधि फायदेमंद बना. इसके अलावा, क्योंकि luciferase अणु अस्थिर है और तेजी से अपमानित पीएच नहीं हैototoxicity है, जो लंबी अवधि के ^{उत्तेजक} 28 रोशनी के दौरान प्रकट कर सकते हैं. साथ में ले ली, इन गुणों लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों luciferase संवाददाता प्रौद्योगिकी अत्यधिक circadian अनुसंधान के क्षेत्र में लाभप्रद बनाने की अनुमति देते हैं.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

000000000091984 FONCICYT, Jeansson की नींव, Söderström Königska sjukhemmet, मरथा Lundqvist और Sigurd OCH Elsa यह काम स्वीडिश चिकित्सा अनुसंधान परिषद (K2009-75SX - +२१०२८-01-3, K2008-61X-२०७००-01-3) द्वारा वित्त पोषित किया गया था Goljes Minne, और SLS 95,151 मेडिसिन के स्वीडिश सोसाइटी. प्रोफेसर जीन डी ब्लॉक, UCLA, कृतज्ञता पांडुलिपि पर बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए स्वीकार किया है. हम HCN चैनल अवरोधक के लिए डॉ. माइकल Andäng और डॉ. हेलेना Johard धन्यवाद, और वीडियो खुर्दबीन प्रदान करने के लिए प्रो अब्दुल अल - Manira.

नैतिक आधार:

सभी जानवरों पर प्रयोगों के कारोलिंस्का Institutet और "स्टॉकहोम Norra Djurförsöksetiska Nämnd" द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. सभी पशु प्रयोगों इरादे के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं किसी भी संभावित तनाव या पशु के लिए परेशानी कम से कम.

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