Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

1. Основные настройки Прежде чем приступить к Препарирование:

1. Соответствующие объемы полной среде НСК получают путем смешивания NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения дополнений в 9:01 отношения, соответственно.
2. Средний разогревается в 37 ° С водяной бане.
3. Холодная HEPES буфером минимальной необходимой среде (ВЭМ) с высокой концентрацией антибиотиков (10%) получают для вскрытия и стиральные цели. Кроме того, НСК базальной среды с дополнением антибиотиков может также использоваться для этой цели.
4. 25-30 мл холодной HEM, содержащие антибиотики разливают в стерильные 50 мл пробирки для сбора эмбрионов.
5. Несколько 10см пластиковые чашки Петри необходимо провести эмбрионов и мозг во время вскрытия, а также провести расчлененный ткани.
6. Хирургические инструменты, необходимые для удаления эмбрионов (большие ножницы, маленькие ножницы отметил, большие щипцы, маленькие изогнутые щипцы), или для эмбрионального вскрытия головного мозга (малый щипцов, изогнутых тонких щипцов, 45 ° угловой штраф щипцы, и маленькие ножницы) стерилизуют использованием стеклянная бусина стерилизатора при температуре 250 ° С или другим доступным методам автоклаве.
7. Препарирование микроскоп протирают 70% спиртом и создать внутри ламинарного потока или PC2 капотом.

2. Сбор E14 мозга мыши и Micro-рассечение:

1. Время повязана беременных мышь под наркозом в день ^14-й беременности в соответствии со своими институциональными утвержденным животных протокола.
2. Шейки дислокации осуществляется, чтобы убедиться, животное не страдать от боли и страданий.
3. Наркозом мыши укладывается на спину на фильтровальной бумаги ткани и живота промывают 70% этанолом для стерилизации области.
4. Кожа на животе захватывается с помощью большого пинцета, а затем кожу и лежащий в основе фасции разрезают с большими ножницами, чтобы разоблачить брюшной полости и рогов матки.
5. Матки удаляются с небольшим пинцетом и ножницами и переносят в 50-мл коническую трубку содержащих холодного HEM.
6. Матке передаются на капот, а затем промыть несколько раз с достаточным объемом свежего холодного стерильного HEM для удаления возможных загрязнений, как кровь и волосы.
7. Маточной ткани затем перевели в 10 см блюдо Петри с холодной HEM.
8. Рогах матки открываются с помощью небольших изогнутых щипцов и ножниц и эмбрионы переносятся на новое блюдо 10 см, который содержит холодной HEM.
9. Главы эмбрионы разделяются на шейный уровне спинного мозга, и переданы другому чашке Петри содержащие холодной HEM.
10. Чашке Петри, передается согласно рассекает микроскопом, чтобы удалить мозг от черепа.
11. Главы проводятся с тонкой изогнутой щипцы из хвостовой стороне, так как спинной стороне головки вверх. Использование микро-ножницы, первый горизонтальный надрез над глазами, а затем продолжил в средней линии от лба к затылку. Убедитесь в том, чтобы прорваться через кожу и череп и, чтобы не повредить лежащий в основе мозга.
12. Мозг удален из черепа, нажав края разреза сечения в обратном движения с помощью изогнутых щипцов. Эта процедура продолжается, пока все мозги удаляются из черепов.
13. Мозг неизменным использованием изогнутых щипцов, так что спинной стороне вверх и затем с помощью microscissors разрез выполняется через коре каждого полушария простирается от обонятельных луковиц к задней части полушария подвергать ганглиозные возвышения.
14. Использование изогнутых щипцов в одной руке и 45 ° угловой щипцами в другой, вырезать полы коре распространение и ганглиозные возвышенности расчленены из.
15. Расчлененный ткани помещают в стерильную чашку Петри 10 см, и эта процедура повторяется, пока все мозги были микро-расчленены.
16. Ткань части собраны с использованием 1 мл среды НБК в 1 мл пипетки и переносят в 15 мл центрифужную пробирку.
17. Ткань затем диссоциирован тщательно, но осторожно, нажимая кончиком пипетки на дне пробирки и пипетки подвески вверх и вниз. Таким образом, сгустки разбиты на отдельные клетки. Пипетирование проводится 3-4 раза, так что, как молочный подвески достигается. Затем, подвеска разрешили селиться в течение 1-2 минут, так как не-диссоциированных скопления осадков.
18. Почти весь суспензии клеток передается в другую трубу, а затем еще на 1 мл среды НСК добавляется к оставшимся сгустки и диссоциированных в одной ячейке, как описано.
19. Содержание трубы собирали и центрифугировали в течение 5 минут при комнатной температуре, при 700rpm (110г).
20. Супернатант пылесосом от до фактического гранул, а также клетки ресуспендировали в 1 мл полной среды НСК.
21. Среда осторожно пипеткой вверх и внизесть однородная суспензии отдельных клеток.
22. 10 мкл суспензии клеток смешивают с 90 мкл трипанового синего выполнять клеток.
23. Наконец, клетки высевают на плотность 2х10 ^{5 клеток} / мл в полной среде НСК дополнен 20ng / мл эпидермального фактора роста (EGF). 5 мл среды для T25, 20 мл для T75 и 40 мл для T175 колб.
24. Нейросферы формируются в течение 5-7 дней, когда инкубировали при 37 ° С в увлажненной инкубаторе с 5% CO _2. В 6-7 дней, сферы должны измерять между 150-200 микрон, и будет готов к субкультуре (прохода).

3. Пассажей и расширения эмбриональных NSCs:

1. Когда нейросферы готовы к субкультуре (150-200 мкм в диаметре), среда с приостановлено сферы удаляется из колбы, размещенные в соответствующих размеров стерильную пробирку культуре ткани, и центрифугировали со скоростью 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Супернатант отбрасывается и сфер ресуспендируют в 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА.
3. Клеточной суспензии затем инкубировали в 37 ° С водяной бане в течение 2-3 мин, затем равный объем сои ингибитор трипсина используется для остановки трипсина деятельности.
4. Клеточной суспензии осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы трипсина был полностью инактивируется.
5. Клеточной суспензии центрифугируют при 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин. Затем супернатант удаляли, а клетки ресуспендируют в 1 мл полной среды НСК.
6. 10 мкл суспензии клеток смешивают с 90 мкл трипанового синего выполнять клеток.
7. Клетки высевают при концентрации 5х10 ^{4 клеток} / мл в полной среде НСК дополнен 20ng / мл ЭФР в соответствующие колбы культуре ткани размером. 5 мл среды для T25, 20 мл для T75 и 40 мл для T175 колб.
8. Вторичные нейросферы формируются в течение 5-7 дней, когда инкубировали при 37 ° С в увлажненной инкубатор с 5% CO _2.

4. Представитель Результаты:

В первичной культуре эмбриональных НСК, большинство клетки станут гипертрофических и приложить к культуре ткани блюда на обшивке. В то время как большинство клеток будет либо умереть или дифференцироваться, через 2-3 дня, пролиферативные клетки делают небольшие скопления клеток, которые будут отключаться от подложки (рис. 1). Формирование большие сфероидальные агрегатов в первой 48-часовой культуры не следует принимать за основной сферы. Совокупный образование в основном зависит от количества мусора и не диссоциированных тканей скопления в культуре. Правда нейросферы фазе яркие и становятся более сферическими как размер увеличивается (рис. 2). Малый microspikes появляется на внешней поверхности жизнеспособным и здоровым сфер (рис. 3). После 5-7 дней, сферы должна быть круглой, но не сжимаются, и должны измерить от 150 до 200 мкм в диаметре. Если нейросферы могут расти слишком большой (после 9-10 дней в культуре), они могут образовывать агрегаты или становятся темного цвета из-за гибели клеток в центре сферы (см. видео). Большой нейросферы может в конце концов начинают дифференцироваться на месте (прикрепление к субстрату и мигрируют по направлению к периферии). Кроме того, трудно отделить большие нейросферы и субкультуры них.

Рисунок 1. Первичные E14 НСК культуры через 3 дня после металлизации. Стрелками показаны пролиферирующих кластеров NSCs. Оригинальные увеличении; 20x

Рисунок 2. Первичные E14 НСК культуры 7 дней после покрытия. Оригинальные увеличении; 10x

Рисунок 3. Прохождение один E14 нейросферы 5 дней после покрытия. Обратите внимание, микро-шипы (стрелки) на периферии сферы. Оригинальные Увеличение; 20x

Neurosphere анализ является методом выбора для изоляции и расширения нервные стволовые клетки ^1-5 из-за своей простоты и воспроизводимости. Этот анализ является бесценным инструментом для крупномасштабных поколения недифференцированных предшественников нервной клетки, которые могут быть использованы для как в пробирке и в естественных исследованиях. Следует подчеркнуть, что нейросферы могли быть получены как из добросовестных нервные стволовые клетки и более ограниченным прародителей. Поэтому, вычисляя neurosphere формирования частоты просто переоценивает количество добросовестных NSCs в той или иной нейронной популяции клеток ^6. Для оценки частоты добросовестных NSCs, настоятельно рекомендуется использовать нейронные колонии Формирование сотовых анализ (N-ЦАФД), который был разработан для этой цели ^7.

Для того, чтобы последовательно высокой культуры neurosphere качество E14 NSCs, мы рекомендуем:

1. Для подготовки необходимых вещей, прежде чем начать сбор эмбрионов.
2. Чтобы сохранить эмбрионов в холодной HEM или базальной среды НСК всей рассечение.
3. Чтобы выполнить рассечение как можно быстрее (в течение 1 ч), а ткань становится мягкой и липкой с течением времени и может быть трудно анализировать.
4. Не дать сферы расти слишком много. Как правило, они должны быть суб-культурных каждые 5-7 дней в зависимости от размера шаров.
5. Для trypsinize сферы в размере 150-200 мкм в течение 2-3 минуты. Оставив трипсина в течение более 3 минут приводит к повреждению клеток и сфера формирования эффективность будет уменьшаться, а клетки, как правило, придают блюдам культуры и дифференцировать.