Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

1. Hipokampal Dilimleri Hazırlama Başlamadan Önce.

1. Teflon levha bir parça yerleştirerek yeni bir bıçak montaj doku dilimleme makinesi hazırlayın.
2. % 70 etanol ile silin ve doku kültürü (TC) kaput diseksiyon mikroskobu içine yerleştirilmiş. Davlumbaz, mikroskop, doku dilimleme makinesi ve UV ışığı ile 15 dakika boyunca tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
3. Altı iyi TC tabak hazırlayın. Her bir kuyunun 750 mcL dilim kültür ortamı (SCM), başına iyi yer ve hücre kültürü ekler ekleyin. Membranlar altında kabarcıklar ile iyice ıslak emin olun. 35 kuvöz tabak yerleştirin ° C kadar gerekli% 5 CO ₂ ile gaz verilerek.
4. 100 ml beher içine 50 ml düşük Na ⁺ ACSF (çözüm diseksiyon) dökün ve buz-tuz karışımı yerleştirin. Kabarcık düşük Na ⁺ ACSF% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ ile renk değişimleri ve ACSF, dondurulmuş ve sıvı solüsyonu (10-20 dakika) bir bulamaç karışımı oluşturana kadar .
5. P5-P7 sıçan yavru alın. Kadar üç yavrular kullanılabilir.

2. Hipokampal Dilimleri hazırlanması.

1. Hayvan başkanı, keskin bir yardımcı program makas ile kesin. Cildi kesin ve kafatası maruz. Sonra küçük makas ile sagital sütür boyunca interaural hat boyunca yan yana gelen kesme ve kafatası açın. Kemik ve beyin maruz kaldırarak kolaylaştırmak için ön yan yana isteğe bağlı kesim yapılabilir. Yuvarlak bir kaşık mikro spatula ile hızlı bir şekilde beyin kepçe ve yaklaşık 1 dakika süreyle soğuk çözüm diseksiyon bulamaç yerleştirin. 60 mm bir tabağa buz soğuk diseksiyon çözüm ~ 10 ml dökün ve beher çanak beyin transferi. Beyin çözüm diseksiyon ile kaplanmış olmalıdır.
2. Altında mikroskop diseksiyon: Yer beyin ve 60 mm çanak alt basıldığında diseksiyon forseps ile orta hat tutun. Ortabeyin bırakarak hemisferlerin ayrı hipokampus kesme aleti kullanın. Hippocampi sonra her yarımkürede maruz kalmaktadır. Sonra yavaşça aracı diseksiyon hipokampus hipokampus kepçe. Hipokampus tamamen izole etmek ve mümkün olduğunca temiz diseksiyon iğnesi kullanın.
3. Snipped P1000 filtre pipet ucu hafifçe hipokampus aspirat ve doku dilimleme makinesi teflon levha aktarmak. Konkav hipokampus yerleştirin.
4. Koronal bölümleri almak ve aşırı sıvı drenaj hippocampi dik bıçak hizalayın.
5. Hippocampi her 400 mikron dilimleyin.
6. ~ 10 ml soğuk SCM, dilimleme makinesi, başka bir snipped P1000 filtre ucu ve soğuk SCM kullanarak hippocampi dilimlenmiş bir 60 mm bulaşık ve transfer içine dökün. Kabarcıklar yapmak kaçının.
7. Iris spatula ve düz bir spatula yardımıyla hafifçe birbirinden dilim ayırın.
8. Iyi tanımlanmış ve hasarsız hasarlı dilim dilim ayırın.

3. Hipokampal Dilimleri Kültür

1. Inkübatör SCM ve hücre kültürü ekler ile altı kuyucuğu getirin. Başka bir snipped P1000 filtre ucu yardımı ile tek tek dilimler, membran üzerine aktarın. Membran başına 4-5 dilimleri yerleştirin. Dilimleri eklemek duvar ya yakın ya da birbirlerine yakın yerleştirmek için dikkatli olun. Gerektiğinde ayrı dilim iris spatula kullanın. Aşırı orta çıkarın. Membran bir dilim mümkün olduğunca az dokunun.
2. Geri inkübatör plaka ve kültür 35 ° C ve% 5 CO ₂ taşıyın.
3. SCM Pasteur pipeti ile aspire TC kaput içinde SCM her 48 saat değiştirin. Taze önceden ısıtılmış SCM de ortalama 750 mcL ekleyin. Membranın altında kabarcıklar oluşur emin olun.

4. Çözümler

1. Düşük Na ⁺ ACSF - dilim kültürlere Diseksiyon Çözüm
   Deiyonize ve steril H ₂ O eklemek için:
   

   	500 ml için	1000 ml için	Final Konsantrasyon
   CaCl 2 (1 M)	0,5 mL	1 ml	1 mM
   D-glikoz	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mM
   MgCl 2 (1 M)	2.5 mL	5 ml	5 mM
   NaHCO 3	1.092 g	2.184 g	26 mm
   Sakaroz	40 g	80 g	234 mm
   DPBS Fenol Kırmızı Çözüm% 0.5	0,5 mL	1 ml	% 0.1 v / v

   
   Mix ~ 30 dk.
   Steril0.22μm filtre geçişi tarafından ize
   4 ° C artık 2 aydan az 50 ml alikotları ve mağaza olun.
2. Dilim Kültür Orta (SCM)
   

   	500 ml için	1000 ml için	Final Konsantrasyon
   MEM Eagle orta	4.2 g	8.4 g	8.4 g / l
   At serum ısı inaktive	100 mL	200 mL	% 20
   L-Glutamin (200 mM)	2.5 mL	5 ml	1 mM
   CaCl 2 (1 M)	0,5 mL	1 ml	1 mM
   MgSO 4 (1 M)	1 ml	2 mL	2 mM
   İnsülin (1 mg / ml), 0.01 N HCl içinde çözünmüş	0,5 mL	1 ml	1 mg / l
   Askorbik Asit, çözüm (% 25 w / v)	0.024 ml	0.048 ml	0,00125%
   D-glikoz	1.16g	2.32g	13 mm
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5.2 mM
   HEPES	3.58g	7.16g	30 mm

   
   Iyice eriyene kadar karıştırın ve oda sıcaklığına getirmek.
   1 N NaOH ile pH 7,27-7,28 için ayarlayın.
   Ölçü ozmolarite. Deiyonize ve sterilize H ₂ O. ile 320 mmol / kg ayarlayın Yaklaşık 25-40 ml eklemek için bekliyoruz. Ozmolarite yeniden kontrol edin.
   Ozmolarite ayarlayarak, *** pH biraz değişebilir, bu tamam, ozmolarite doğru aralığı (317-323) olduğunu daha önemlidir.
   0.22 mikron filtre geçişi ile sterilize edin.
   20 ml alikotları ve mağaza olun az iki-üç hafta kadar 4 ° C
   Gluatamine stok: -20 ° C'de 2.5 mL hacimde 200 mM ve mağaza bir konsantrasyon hazırlamak.
   Askorbik asit stoğu:% 25 (w / v) 'lik bir konsantrasyon hazırlamak ve 100 mcL hacimde -20 ° C'de saklanır.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Dilimler diseksiyon kapsamında beyaz, siyah noktalar olmadan bakmak ve iyi tanımlanmış ve hasarsız CA1, CA3 ve dentat girus bölgelerinin. Bakteriyel kontaminasyon kolayca SCM orta veya bulanıklık hareket eden siyah lekeler olarak görülür. Mikroskop altında konulduğunda, dilim yüzey açık ve ayırt edilir hücre organları ile 4 gün sonra kültür temiz görünmelidir. Net hücre gövdeleri görülür ve çok enkaz 4 gün sonra yüzeyini kaplayan, daha sonra sağlıklı bir dilim değildir.

Bu yöntem ¹¹ ilk Stoppini ve ark tarafından tanımlanan yöntem ve kültür hipokampal dilimleri hızlı bir şekilde sunuyor. Bu protokolün en önemli yönü dilim steril korumak için, bu nedenle uygun steril teknikler kullanmak ve düzgün doku ile temas eden tüm malzeme dezenfekte ve sterilize etmek için kritik öneme sahiptir.

Farklı serumlar kaynakları dilimleri kalitesini etkileyebilir. Biz ilk birkaç toplu test tavsiye ederiz. Kontaminasyon tekrarlayan bir sorun ise, inkübatör ve muhtemel kirlilik kaynakları için doku kültürü kaputu kontrol edin. Tüm prosedürü sırasında steril tekniklerin uygun kullanımı esastır.

Dekapitasyon membran ve inkübatör dilimleri yerleştirerek için toplam süre 1.5 saatten daha uzun olmamalıdır. Prosedür çok uzun sürerse, dilim sağlığı tehlikeye sokacaktır.

SCM kapilarite tarafından oluşturulan ince bir tabaka ile gözenekli bir membran garantiler uygun oksijenasyon ve beslenme dilim yerleştirilmesi. Bu yöntem doku yoğunluğu, uygun oksijenasyon ve besin penetrasyon sağlar koşuluyla diğer beyin bölgelerine adapte edilebilir. Böylece, doku yoğunluğu genç doku için bu yöntemi sınırlar. Hipokampus, p6 p7 hayvanlar 300-400 mikron kalınlığında dilimler en iyi sonuçlar verecek gibi görünüyor. Dilim Bu tür hızla azalan doku havaya maruz kaldığı zaman bir doku dilimleme makinesi ile elde edilebilir.

Kültürün bir kaç gün sonra, sinaptik fizyolojisi eğitimi önemlisi, ölü hücreleri tüm enkaz elektrofizyolojik veya görüntüleme deneyleri için temiz bir yüzey son derece uygundur bırakarak kaldırılır olmuştur. Buna ek olarak, Organotipik hipokampal dilim akut dilim ¹² karşılaştırılabilir normal bağlantı geliştirmeye devam. Ancak nöronlar dilim sinaptik aktiviteyi artırır çok sayıda bağlantı oluşturan başlangıç ​​olarak 2 hafta sonra bu normal bir kültür bağlantısı kaybolur.