Organotypic hippocampus Slice kulturer

1. Innan Beredning av hippocampus skivor.

1. Förbered vävnaden slicer genom att placera en bit av teflon plåt och montera ett nytt blad.
2. Torka vävnadsodling (TC) huva med 70% etanol och ställ dissekera mikroskop insidan. Sterilisera huven, mikroskop, vävnad slicer och alla dissekera instrument i 15 minuter med UV-ljus.
3. Förbered sex väl TC plattor. Tillsätt 750 mikroliter media slice kultur (SCM) per brunn och placera cellen infogar kultur i varje brunn. Se till att membranen är genomblött utan bubblor under. Placera plattorna i inkubatorn vid 35 ° C gasade med 5% CO ₂ tills det behövs.
4. Häll 50 ml låg Na ⁺ ACSF (dissekera lösning) i en 100 ml bägare och placera den på is-salt blandningen. Bubble låg Na ⁺ ACSF med 5% CO ₂ / 95% O ₂ tills ändrar färg och ACSF bildar en slurry blandning av fryst och flytande lösning (10-20 min).
5. Skaffa en P5-P7 hos råttungar. Upp till tre ungar kan användas.

2. Hippocampus Slices Förberedelser.

1. Skär huvudet av djur med vassa verktyg sax. Skär huden och exponera skallen. Öppna skallen genom att klippa från sida till sida längs interaural linjen och sedan längs sagittala suturen med en liten sax. En valfri klippa från sida till sida i fronten kan göras för att underlätta att ta bort ben och exponeringen av hjärnan. Gröp ur hjärnan snabbt med en rundad sked mikro spatel och placera den i slammet i dissekera lösning för att kyla för ~ 1 minut. Häll ~ 10 ml iskall dissekera lösningen på en 60 mm skålen och överför hjärnan från bägaren till skålen. Hjärnan bör täckas med dissekera lösning.
2. Enligt dissecting mikroskopet: Placera hjärnan och håll den vid mittlinjen med dissekera pincett pressas mot botten av 60 mm skålen. Använd hippocampus dissekera verktyg för att separera halvkloten utelämna mellanhjärnan. Den hippocampi sedan utsätts för varje halvklotet. Sedan försiktigt scoop hippocampus ut med hippocampus dissekera verktyget. Använd dissecting nål för att helt isolera hippocampus och rengör den så mycket som möjligt.
3. Med hjälp av en klippt spetsen på en P1000-filter pipettspets försiktigt aspirera hippocampus och överföra den till Teflon arket på vävnaden slicer. Placera hippocampus på dess konkava sida.
4. Rikta in hippocampi vinkelrätt mot bladet för att få koronalt sektioner och avlopp överskott av vätska.
5. Skiva hippocampi var 400 ìm.
6. Häll ca 10 ml kallt SCM i en 60 mm skålen och överför skivade hippocampi från slicer använda ett annat klippt P1000 filter spets och kalla SCM. Undvik att göra bubblor.
7. Med hjälp av en iris spatel och en rak spatel försiktigt separera skivor från varandra.
8. Separata väl definierade och oskadade skivor från skadade skivor.

3. Hippocampus Slices Kultur

1. Ta med sex-och plattor med SCM och cell infogar kultur från inkubatorn. Med hjälp av en annan klippt P1000 filter spets, överföra enskilda skivor på membranet. Placera 4-5 skivor per membran. Var noga med att inte placera skivor antingen nära skäret vägg eller nära varandra. Vid behov använder iris spatel till separata skivor. Ta bort överflödig medium. Tryck på skivor så lite som möjligt när de är på membranet.
2. Flytta plattan tillbaka till inkubatorn och kultur vid 35 ° C och 5% CO _2.
3. Ändra SCM var 48 timmar inne i TC huva som aspirerande SCM med en pasteurpipett. Tillsätt 750 mikroliter av färska förvärmda SCM per brunn. Se till att inga bubblor bildas under membranet.

4. Lösningar

1. Låg Na ⁺ ACSF - Analysera lösning för slice kulturer
   Att avjoniserat och sterila H ₂ O lägga till:
   

   	För 500 ml	För 1000 ml	Slutlig koncentration
   CaCl 2 (1 M)	0,5 ml	1 ml	1 mM
   D-Glukos	0,901 g	1,802 g	10 mM
   KCl	0,149 g	0,298 g	4 mm
   MgCl 2 (1 M)	2,5 mL	5 ml	5 mM
   NaHCO 3	1,092 g	2,184 g	26 mm
   Sackaros	40 g	80 g	234 mm
   Fenolröttlösning 0,5% i DPBS	0,5 ml	1 ml	0,1% v / v

   
   Blanda ~ 30 min
   Sterilize genom passage genom 0.22μm filter
   Gör 50 ml-portioner och förvara vid 4 ° C längre än 2 månader.
2. Slice odlingssubstrat (SCM)
   

   	För 500 ml	För 1000 ml	Slutlig koncentration
   MEM Eagle medelstora	4,2 g	8,4 g	8,4 g / l
   Hästserum värmeinaktiverad	100 ml	200 ml	20%
   L-glutamin (200 mm)	2,5 mL	5 ml	1 mM
   CaCl 2 (1 M)	0,5 ml	1 ml	1 mM
   MgSO 4 (1 M)	1 ml	2 ml	2 mM
   Insulin (1 mg / ml), löst i HCl 0,01 N	0,5 ml	1 ml	1 mg / l
   Askorbinsyra, lösning (25% w / v)	0,024 mL	0,048 mL	0,00125%
   D-Glukos	1.16g	2.32g	13 mm
   NaHCO 3	0.22g	0.44g	5,2 mm
   Hepes	3.58g	7.16g	30 mM

   
   Blanda tills noggrant upplöst och sätta till rumstemperatur.
   Justera pH till 7,27 till 7,28 med 1 N NaOH
   Mät osmolaritet. Justera till 320 mmol / kg med avjoniserat och steriliseras H ₂ O. Räkna med att lägga ca 25-40 ml. Kontrollera osmolaritet igen.
   *** PH kan ändras något vid justering osmolaritet, detta är ok, är det viktigare att osmolaritet är i rätt område (317-323).
   Sterilisera genom passage genom 0,22 ìm filter.
   Gör 20 ml och lagra upp till två tre veckor vid 4 ° C.
   Gluatamine lager: Förbered vid en koncentration av 200 mm och förvara vid -20 ° C i portioner om 2,5 ml.
   Askorbinsyra lager: Förbered vid en koncentration på 25% (w / v) och förvaras vid -20 ° C i portioner om 100 mikroliter.

5. Representativa resultat:

Skivor ska se ut vitt under en dissekera räckvidd utan svarta fläckar och väl definierade och oskadade CA1, CA3 och dentate regioner gyrus. Bakteriell kontaminering är lätt ses som rörliga svarta fläckar på medellång eller grumlighet av SCM. När den placeras under mikroskop, skall ytan för den del ser rent efter 4 dagar i kultur med tydliga och märkbart cell organ. Om inga klara cellen kroppar ses och mycket skräp täcker ytan efter 4 dagar, sedan är inte en frisk bit.

Denna metod är baserad på den metod som först beskrevs av Stoppini et al. Och ¹¹ erbjuder ett snabbt sätt till kultur hippocampus skivor. Den viktigaste aspekten av detta protokoll är att upprätthålla skivor steril, därför är det viktigt att använda lämpliga sterila tekniker och att korrekt desinficera och sterilisera allt material i kontakt med vävnad.

Olika serum källor kan påverka kvaliteten på skivorna. Vi rekommenderar att du provar flera partier först. Om förorening är ett återkommande problem, kontrollera inkubator-och vävnadsodling huva för möjliga smittkällor. Korrekt användning av sterila tekniker under hela förfarandet är viktigt.

Den totala tiden från halshuggning för att placera skivor på membranet och i kuvösen bör vara längre än 1,5 timmar. Om förfarandet tar för lång tid kommer det att äventyra hälsan för skivor.

Placera skivorna på en porös membran garantier ordentlig syresättning och nutrition via ett tunt lager av SCM som bildas av kapillärkraften. Denna metod kan anpassas till andra delar av hjärnan ger att densiteten av vävnaden gör rätt syresättning och näringsämnen penetration. Således begränsar vävnad täthet denna metod för att unga vävnad. För hippocampus, skivor 300-400 ìm tjocka från P6-P7 djur verkar ge bästa resultat. Denna typ av skivor kan snabbt uppnås med en vävnad slicer minskar den tid som vävnaden utsätts för luft.

Viktigt för dem som studerar synaptisk fysiologi, efter några dagar i kultur, har alla skräp från döda celler tagits bort och lämnar en ren yta mycket lämplig för elektrofysiologiska eller avbildning experiment. Dessutom fortsätter organotypic hippocampus skivor utveckla normal uppkoppling jämförbart med akut skivor ^12. Men efter 2 veckor i kulturen här normala uppkoppling försvinner som nervceller börja bilda för många anslutningar som ökar synaptisk aktivitet i segmentet.