התגובות מדידת אור היממה ואת חריפה בעכברים באמצעות פעילות גלגל ריצה

Abstract

מקצבי היממה הן פונקציות פיזיולוגיים כי מחזור על פני תקופה של כ 24 שעות (בסביבות היממה-: המשוערים דיאם: יום) ^{1, 2.} הם אחראים תזמון השינה שלנו / מחזורים בעקבות הפרשת ההורמון. מאז תזמון זה לא בדיוק 24 שעות ביממה, הוא מסונכרן יום השמש על ידי קלט אור. מטרה זו מושגת באמצעות קלט photic מהרשתית אל גרעין suprachiasmatic (SCN) אשר משמש קוצב האב סנכרון שעונים היקפי באזורים אחרים של המוח ורקמות היקפי מחזור סביבתי בחושך אור ^3-7. ההתאמה בין המקצבים מחזור סביבתי האפל הזה אור מארגן אירועים פיזיולוגיים במיוחד נישה הזמני לתקן, אשר הוא חיוני להישרדות ^8. לדוגמה, עכברים לישון במהלך היום הם פעילים בלילה. יכולת זו כדי לבסס את הפעילות או את החלק בהירים או כהים של היום נקרא photoentrainment היממה ודורש קלט אור השעון הביולוגי ^9. פעילות של עכברים בלילה הוא חזק במיוחד בנוכחות גלגל ריצה. מדידת התנהגות זו היא שיטה פולשנית כי ניתן להשתמש כדי להעריך את התפקוד של מערכת היממה וכן קלט אור למערכת הזאת. שיטות זה יהיה מכוסה כאן משמשים כדי לבחון את שעון היממה, קלט אור במערכת זו, כמו גם השפעה ישירה של אור על התנהגות גלגל ריצה.

Protocol

1. ציוד ההתקנה

1. ההכנה של קבוצות בעלי חיים חשוב מאוד בעת הגדרת כל ניסוי התנהגותי. עבור פעילות גלגל ריצה, עכברים כל צריך להיות זכר, גיל מתאימים, ואם אפשר מתוך זיווגי אחים. עכברים צעירים באופן אידיאלי, כ 3 חודשים, משמשים לפעילות גלגל ריצה.
2. לפני הצבת כל חיות על גלגלים, החדר צריך להיות לגמרי ההתקנה. זה כולל את הכנת כל כלוב עם גלגל 1, 1 גלגל המהפכה בדיקה, כמות קטנה של מצע העכבר בתחתית הכלוב כל מזון, מים בשפע עבור 2 שבועות.
3. תאורת חדר חשוב מאוד, בעת הגדרת כלובים גלגל ריצה חשוב למדוד את עוצמת האור על כל כלוב כדי לוודא שאתה מקבל אפילו תאורה בכלוב אחד. יתר על כן, בעת בחירת מקור אור, לחפש אחד עם קשת רחבה מכסה 450nm-650nm. חברות רבות מציעות "אור יום" או "ספקטרום מלא" נורות פלורסנט, אשר עומד בקריטריון זה. (ראה תרשים 1)

2. הגדרת ניסוי

1. כאשר מציגה עכברים לכלוב גלגל ריצה, לעשות זאת במחזור אור אשר תואם במידה רבה את מחזור אור / חושך הם שוכנו בעבר תחת.
2. נסו לפזר באופן אחיד עכברים טובה יותר להבטיח סביבות דומות לכל הקבוצות. למשל, להימנע באשכולות כל קבוצה אחת של עכברים באזור מסוים כגון מדף בודד. זה יכול בטעות להכניס משתנה נוסף.
3. לפני ביצוע כל הפרעות מחזור אור או מדידת הפעילות, אתה צריך לתת עכברים כשבוע להסתגל לכלוב החדש, גלגל. עכברים כל זה לא פועל על הגלגלים לאחר שבוע יש להוציא מהכלוב והחליפו עם עכבר אחר.
4. ברגע שיש לך קבוצה של בעלי חיים ביציבות רץ על גלגלים, אתה יכול להתחיל בהקמת מחזורי אור / חושך כדי לבחון השערות שונות. מחזורי אור שונים הם דנו בפירוט חלק 3.

3. ניסיוני מבחני

1. כדי photoentrainment assay, להתחיל עכברים דיור של 12 שעות אור: מחזור 12 שעות חושך. דוגמה לכך תהיה אורות מ 07:00-7: 12:00 בעוד האורות להישאר מן 19:00-7:00. בנוסף, הנמכת עוצמת האור עבור חלק ח 12 אור של מחזור יחשוף את כל ההבדלים רגישות לאור עבור photoentrainment. עכברים צריכה להינתן שבועיים photoentrain ולפני שינוי עוצמות האור. (איור 2)
2. היבט נוסף של photoentrainment היא היכולת להתאים מחדש מחדש או לעלות לרכבת מקצבי היממה כדי באור חדש / מחזור כהה. זה יכול להיבחן על ידי קידום במחזור אור / חושך כי עכברים הם שוכנו כך האורות יהיה לכבות ולהדליק קודם לכן. בדרך כלל, מחזורים אור מתקדמים על ידי 6 שעות, למשל, במקום מחזור אור של 07:00-7: 12:00, זה יהיה 01:00-1: 12:00. זה יכול להיות גם נבדק על ידי דחיית מחזור אור. עכברים הם בדרך כלל מסוגלים מחדש לעלות לרכבת בימים 5-7. (איור 3)
3. פרדיגמות אלה אינם, עם זאת, להעריך באופן מלא את הפונקציונליות של השעון הביולוגי אנדוגני. עכברים השיכון בתנאי חושך קבוע ניתן להשתמש כדי למדוד את תקופת היממה אנדוגני המכונה גם תקופת רץ חופשי. אצל בעלי חיים ליליים כגון עכברים סוג בר, תקופת אנדוגני הוא פחות מ -24 שעות, כלומר הם מתחילים לרוץ על ההגה מעט מוקדם יותר בכל יום. (איור 2) הזמן המדויק של תקופה זו משתנה מעט בין זנים שונים העכבר. לדוגמה, את תקופת ריצה חופשית של C57 עכברים היא כ 23.3 שעות ואילו BALB / CJ עכברים הוא 22.5 שעות ^10.
4. לאחר קביעת תקופה ריצה חופשית קלט התנאים קבוע כהה אור למערכת היממה ניתן לבחון דרך שלב משתנה. שלב הסטה היא היכולת של הדופק אור חריפה להעביר את שעון היממה. שלב הסטה יכול להתבצע על ידי מתן פולסים אור קצר (15 דקות; 1000lux) בשלב פעיל של עכברים שוכנו חושך קבוע ומדידת תחילתה של הפעילות בימים הבאים דופק את האור הזה. (איור 4) מחקרים קודמים הניבו עקומות התגובה (כינה בתגובה עקומות שלב) המתארים את הכמות ואת הכיוון של השינוי מבוסס על מה הפעם אור ניתנת ^{11, 12.} לדוגמה, 15 דקות, 1000 lux אור הדופק ניתן 4 שעות לאחר תחילת הפעילות (CT16) יוביל עיכוב 2 שעה בפעילות, ואילו הדופק אור אותו נתון 8 שעות לאחר תחילת הפעילות (CT20) יוביל כדי לקדם 2 שעה. (איור 4)
5. כדי לבדוק את ההשפעה הישירה של אור על פעילות גלגל ריצה, דופק אור יכול להיות מנוהל על עכברים בשלב כהה / פעיל. הנוכחות של אור בשלב זה ימנע גלגל ריצה הפעילות. בעוד אורך פולס האור הזה יכול להשתנות, מצאנו כי דופק 3 שעות החל 2 שעות אחרי תחילת השלב החשוך ביותר הוא אינפורמטיבי. (איור 5) במקרים מסוימים, זה יכול להיות שימושי כדי לבסס פעילות לקראת המבחן הזה, אתה יכול לעשות זאת בקלות על ידי שינוי זה מחזור אור להדליק h 16: מחזור 8 שעות חושך שבוע לפני מתן דופק את האור.
6. עיכוב זה של גלגל ריצה הפעילות ישירות על ידי אור ניתן לבדוק בכל שלבי מחזור היממה באמצעות מחזור (T7) ultradian אור ^13. מחזור זה מורכב אור 3.5h: 3.5 שעות כהה למשך שבוע 1 ^13. עכברים אינם מסוגלים photoentrain המאפשר להבזקי האור ליפול על כל הנקודות במחזור היממה במהלך טיפול 1-השבוע. (איור 6)
7. בדומה בתנאי חושך קבוע, עכברים דיור אור קבוע יגלה תקופה מאפיין לרוץ חופשי. עם זאת, בתקופה זו יהיו יותר בתקופה מצאו בחשיכה מתמדת. אורך תקופת הפעלת חופשי לאור קבועים בקורלציה חיובית עם עוצמת אור ^14; כמו מגדילה את כמות האור וכך גם אורך תקופת חופשית פועל. (איור 7) עם זאת, בעכברים מראים תקופות רחוקות יותר מ 26 שעות. במקום זאת, תחת אור בהיר, הפעילות שלהם יהיה בקצב לא סדיר. מסיבה זו, היא עוצמת האור הוא שיקול חשוב אם אתה מתכוון להשוות את אורך תקופת לאור מתמיד.
8. כאשר מחליטים אשר על מנת לבצע הפרעות אלה אור, זכור כי מחזורי אור לפני יכולה להשפיע על קצב היממה. מסיבה זו, עדיף להתחיל עם טיפולים המתונה ביותר הראשונה בהדרגה לעבור טיפולים באור חמור יותר. למשל, מבחני photoentrainment, כהה מתמיד, משמרות שלב כולם קלים מאוד, לא נראה לגרום לתופעות לטווח ארוך. מצד שני, מחזור T7 ואור קבוע טיפולים באור קשה מאוד והוא יכול להוביל הפרעות הקצב צריך להיות שמור לסוף הניסוי.

4. ניתוח נתונים

1. גלגל ריצה הפעילות נאסף מספר מהפכות גלגל המתרחשים בתוך תקופת זמן נתונה זרקת לפח. זה בן או מרווח הדגימה היא בדרך כלל 10 דקות. נתונים ניתן להציג גיליון אלקטרוני של Excel המציג את מספר מהפכות גלגל בתוך כל סל. זה יכול להיות שימושי לכימות והשוואה מהפכות הגלגל. הנתונים ניתן להציג גם כמו actogram לפיה כמות הפעילות לפח כל מיוצגת על ידי גובה של בר שחור כמו היסטוגרמה. (איור 2)
2. תחילת פעילות מוגדר בתחילת התקף הפעילות שולטים. הפרמטרים המדויקים עשויים להשתנות בין כל פרט, אבל בדרך כלל, אנחנו מחפשים התקף ראשון של פעילות שנמשכת יותר מ -30 דקות.
3. כדי לנתח את היכולת של עכברים photoentrain, ישנם מספר צעדים שניתן הביט. שיטה נפוצה המשמשת לשקול עכבר להיות photoentrained היא התצפית של יחסים יציבים בין תחילת הפעילות של העכבר לקזז של אור, כמו גם אחוז גבוה של פעילות של העכבר להיות מוגבל בשלב כהה.
4. תחילתה של פעילות מספקת את המידע ביותר כאשר מסתכלים entrainment מחדש כדי לקדם מחזור אור / חושך, ואילו פעילות לקזז הוא אינפורמטיבי ביותר כאשר בוחנים מחדש entrainment עיכובים במחזור אור / חושך. עכברים בדרך כלל לוקח 5-7 ימים לחלוטין את הגלגל מחדש לעלות לרכבת שלהם פועל כדי לקדם פעילות 6 שעות או עיכוב של מחזור אור / חושך. כדי לשקול עכבר מחדש לרכבת, בעיקר בתגובה מראש, עליך לשמור על קשר יציב בין תחילת פעילות והאור של קיזוז. מערכת יחסים זו צריכה להיות דומה למה נצפתה מראש על מנת לקדם את מחזור האור צריך להימשך לפחות שלושה ימים. (איור 3)
5. כדי לחשב את תקופת לאור שני כהה מתמיד קבוע, onsets הפעילות צריך להיות נחוש עבור 2 שבועות מצויד קו רגרסיה. כאמור, בעכברים סוג בר, תקופת בחושך קבוע יהיה פחות מ -24 שעות, בעוד תקופה באור קבוע יהיה גדול מ -24 שעות. (איורים 2 ו 7)
6. בחישוב המשמרת הבאה הדופק אור, להתחיל קווי רגרסיה הולם onsets פעילות במשך לפחות 5 ימים לפני 5 ימים אחרי דופק את האור. חישוב ההפרש בין שני הקווים רגרסיה על מנת לקבוע את סדר הגודל של שינוי השלב. (איור 4)

5. נציג תוצאות

כאשר מסתכלים על רשומות גלגל ריצה, אתה אמור לצפות לראות כמה שעות של ריצה רצופה כל עכבר. כי עכברים הם ליליים, זה פועל, או שלב פעיל, יהיה לתאם עם התקופה האפלה בנוכחות מחזור אור / חושך. עכברים חינם ריצה בתנאי הקבוע יהיה גם זה מוגבל לתקופה של פעילות מתמשכת המייצג את השלב הפעיל של הקצב שלהם חופשית פועל. בחשכה מתמדת, זה יהיה קצר יותר מאשר 24 שעות ולאור קבוע,יותר מ 24 שעות. המינהל של 15 דקות 1000lux אור הדופק 4 שעות לאחר תחילת הפעילות (CT16) תגרום תחילת הפעילות מתעכבת בימים הבאים דופק את האור הזה.

איור 1: ספקטרום האור נציג א. ספקטרום האור המיוצר על ידי השמש היא רחבה משוחד יחסית בין 400nm ו 700nm, המהווה את החלק החזותי של ספקטרום האור. ב הספקטרום של פסגות ליבון קל בטווח האינפרא אדום, אשר מוביל הטיה אדום שלה, בעוצמה נמוכה בטווח כחול. ג נורת ניאון אופייני, כולל פסגות דיסקרטית של אור אשר יופיע "לבן" את העין. ד עם זאת, נורות פלורסנט אור יש קשת רחבה גבוה פסגות תדר בדידים. התוצאה היא מקור אור זה לא חם כמו נורת ליבון אבל יש ספקטרום רחב יותר מאשר נורת פלורסנט הממוצע.

איור 2: photoentrainment היממה. Actogram הוא גרף הפעילות של עכבר בודד בו ימים רצופים נרשמות על ציר ה-Y, והזמן הוא זמם על ציר ה-x. פסים שחורים מייצגים את מספר מהפכות הגלגל, ואת הרקע מוצל כדי לתת אינדיקציה של מחזור אור / חושך. בימים 1-8, העכבר שוכן באור 12:12: מחזור כהה. במהלך תקופה זו, העכבר מתחיל לרוץ על קיזוז של אורות מאחד את פעילותה בשלב כהה. בשלב האור, פעילות מינימלית. ביום 9, האורות כבויים, עוזב את העכבר בחשכה מתמדת. ללא מחזור אור, אין קלט השעון הביולוגי, שתוצאתה השעון פועל על זמן אנדוגני שלה. כפי שאתם רואים, הפעילות מתחילה מוקדם יותר בכל יום אינדיקציה לכך את השעון אנדוגני של בעל חיים זה הוא פחות מ -24 שעות.

איור 3: Re-entrainment. Re-entrainment פרדיגמות לערב הסטה מחזור אור או קדימה או אחורה לאלץ את שעון היממה להסתגל מחזור אור חדש. בדוגמה זו, מחזור מתקדמת 6 שעות ביום 9 ועיכב אז 6 שעות ביום 20. בנסיבות שני, כמה ימים נדרשים עבור מלא מחדש entrainment, אולם תלוי בכיוון התנועה ההשפעה היא בולטת יותר תחילת הזמן או לקזז.

איור 4: מקצבי היממה משמרת בתגובה בפולסים קצרים של אור. בעלי חיים א שוכנו בחשיכה מתמדת חופשי לרוץ עם תקופה קצרה מ -24 שעות. ביום 8, 15 דקות 1000-lux אור הדופק ניתן 4 שעות לאחר תחילת הפעילות (CT16). בימים שלאחר מכן, שינוי בזמן תחילת הפעילות הוא ציין. פאזה ההבדל בזמן החזוי של החיה התפרצות (נקבע מפעילות שלהם לפני הדופק אור) ואת הזמן שהם בעצם להתחיל לרוץ על הימים הבאים דופק את האור.
ב התגובה שלב עקומת עבור בעכברים מראה את הסכום ואת הכיוון של שינוי זה יתרחש בתגובה דופק אור קצר בזמנים ספציפיים היממה. פולס האור במהלך היום סובייקטיבי (CT0-12) לא יכול לגרום שינוי משמעותי, המכונה אזור מת. מ CT12-19, עיכוב השלב יכול להיגרם עם עיכוב השיא המתרחשים בתגובה דופק אור CT16. בין CT 19 ו -24, את קצב הפעילות יקדם בתגובה הדופק אור עם התקדמות השיא המתרחשים בתגובה דופק אור CT20.

איור 5: גלגל ריצה היא פעילות עכבות או רעולי פנים בתגובה הדופק אור בלילה. בדוגמה זו, את מעגל האור הוא אור 16h: כהה 8h ו מאחדת פעילות. דופק 3 שעות האור מתחיל 2 שעות לאחר כבים האורות ביום 4. במהלך תקופה זו, יש מעט מאוד פעילות גלגל ריצה לא מראה את היכולת של אור ישירות לעכב פעילות. פעילות יתחדש לאחר דופק את האור.

איור 6: מחזור T7 אור משמש לחשוף עכברים להבזקי האור לאורך כל מחזור היממה. מחזור T7 כולל 3.5 שעות של אור ואחריו 3.5 שעות של חושך. במחזור הזה, עכברים תקיים מקצב צירקדי, אולם הם גם להציג מסווה של פעילות גלגל ריצה במהלך להבזקי האור. כמות הפעילות במהלך האור ניתן להשוות את כמות הפעילות במהלך כהה מידה של מיסוך שאינו משוחד עד היממה.

איור 7: תקופת הארכה באור קבוע

Discussion

מקצבי היממה נמדדו והקליט באורגניזמים שונים לאורך ההיסטוריה. אמנם יש לנו תיאר במיוחד את שיטת ההקלטה מקצבים פעילות בעכברים, טכניקה זו ניתן לשנות בקלות למדוד מקצבים במכרסמים אחרים כגון אוגרים וחולדות, המשמשים לעתים קרובות במחקרים היממה. עם זאת, פרק הזמן freerunning ו מחדש לעלות לרכבת באורגניזמים אחרים ישתנו. למשל, בתקופה freerunning של אוגר בחשכה מתמדת הוא 24.0 שעות, ואילו בעכברים הוא פחות מ -24 שעות. בנסיבות, כי אתה עובד אורגניזם, אשר אינו מתאים לפעילות גלגל ריצה, רבים פרדיגמות אור זהה ניתן להשתמש, אולם קצב פיזיולוגיים שונים צריכים להיות הביט. המדד הדומה ביותר הוא הפעילות הכללית. אצל בני אדם, קופים, כלבים, לעתים קרובות משתמשים חוקרים actigraphy, אשר מודד את כמות התנועה של הפרט. בבני אדם, טמפרטורת הגוף ואת הפרשת מלטונין גם נמדד בדרך כלל יש גם הוכח יש מקצב צירקדי, המסוגלת לשלב משתנה ומסוגל מחדש לעלות לרכבת ^{15, 16.}

למרות שאנו חושבים אלה מקצבים פיזיולוגיים כמו המופעים בדידים, הם מחוברים לגמרי. קצב הפעילות של חיה יכול להיות מעולף הדוק עם קצב את טמפרטורת הגוף, והוא ההופכי של מקצב השינה. יתר על כן, הפרשת מלטונין אשר משמש לעתים קרובות כסמן של שלב היממה, דומה לקצב לישון נורמלי אצל בני אדם. כי אלה מחזורי שזורים כל כך, חקר אפשר ליידע לחזות תוצאות של אחרים. למשל, NPAS2 עכברים שעברו מוטציה, אשר הראה גלגל ריצה רצופה פעילות אף את החלק האפל של מחזור חשוך אור, נבחנו מאוחר יותר פגמים לישון ^17. בעכברים אלו נמצאו לישון הכוללת פחות, עם ירידה המתרחשים בשלב החשוך, "זמן לישון" נורמלי.

פעילות גלגל ריצה מספק דרך יחסית פולשני לבדיקת קצב היממה. פרדיגמות שתוארו לעיל ניתן להשתמש כדי להשלים את ניתוח מפורט של התנהגות היממה. בנוסף, פרדיגמות כגון photoentrainment ודיור בחשכה מתמדת יכול לשמש בתור סקר ראשוני של פנוטיפים היממה שלפני המחקר מרוכז יותר כגון ניתוח לישון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics