Abstract
Circadian 리듬은 생리 기능을하는 약 24 시간의 기간 (circadian - 써카 : 대략과 디엠 : 일) 이상의주기를 1, 2. 그들은 우리의 수면 / 각성주기와 호르몬 분비를 타이밍에 대한 책임이 있습니다. 이시기는 정확하게 24 시간이 아니므로, 그것은 광 입력에 의해 태양 하루에 동기화됩니다. 이것은 망막의 환경 빛이 어둠 사이클 3-7로 두뇌와 주변 조직의 다른 지역에서 주변 시계를 동기화 마스터 심장 박동기 역할을 suprachiasmatic 핵 (SCN)에 빛의 입력을 통해 수행됩니다. 이 환경 빛 어두운주기 리듬의 정렬 생존 8 중요합니다 올바른 시간적 틈새 시장, 특히 생리 이벤트를 실시하고 있습니다. 예를 들어, 마우스는 낮에는 자고 밤에는 활성화됩니다. 햇빛이나 어두운 부분 중 하나에 활동을 통합하기 위해이 기능은 circadian photoentrainment로 언급하고 circadian 시계 9 광 입력을 필요로합니다. 밤에는 생쥐의 활동, 특히 실행 바퀴의 존재에 강력한 있습니다. 이 동작을 측정하면 circadian 시스템의 기능뿐만 아니라이 시스템에 광 입력을 평가하는 데 사용할 수있는 법으로서 방법입니다. 여기에 적용됩니다 방법은 circadian 시계,이 시스템에 광 입력뿐만 아니라 휠 실행 행위에 대한 빛의 직접적인 영향을 검사하는 데 사용됩니다.
Protocol
1. 장비 설치
- 어떤 행동 실험을 설정할 때 동물 단체의 준비는 매우 중요합니다. 휠 실행 행위에 대한 모든 쥐가 남성해야합니다, 나이가 형제 matings에서 일치하고, 가능한 경우. 약 3 개월 이상적인 젊은 생쥐, 휠 실행 활동을 위해 사용됩니다.
- 이전 바퀴에 어떤 동물을 배치하는, 방을 완전히 설정해야합니다. 이것은 1 바퀴 1 바퀴 혁명 프로브, 각 케이지 2 주 동안 충분한 음식과 물을 바닥에 마우스 침구 소량의 각 새장을 준비하고 있습니다.
- 휠 실행 새장을 설정할 때 실내 조명은 당신이 각 새장에서도 조명을 받고 있는지 확인하기 위해 각각의 케이지에서 광도를 측정하는 것이 중요하다, 매우 중요합니다. 또한, 광원을 선택할 때, 450nm - 650nm 걸쳐 광범위한 스펙트럼 한를 찾으십시오. 많은 기업이 기준을 충족 "데이 라이트"또는 "전체 스펙트럼"형광 전구를 제공합니다. (그림 1 참조)
2. 실험 설정
- 바퀴 실행 새장에 마우스를 소개하면, 밀접하게 그들이 이전에 아래에 보관되어 있던 어둠 / 빛이주기를 일치하는 빛의주기에 이렇게.
- 고르게 더 나은 모든 그룹에 대해 유사한 환경을 보장하기 위해 마우스를 배포하려고합니다. 예를 들어, 같은 단일 선반과 같은 특정 지역의 생쥐 한 그룹의 모든 클러스터링 자제. 이것은 실수로 추가 변수를 소개 수 있습니다.
- 어떤 조명 사이클 perturbations 만들기 또는 활동을 측정하기 전에, 당신은 생쥐에게 약의 새로운 창구로 적응하는 주, 그리고 바퀴를 제공해야합니다. 일주일 뒤에 바퀴에서 실행되지 않은 생쥐는 케이지에서 제거하고 다른 마우스로 교체해야합니다.
- 일단 안정 바퀴에서 실행되는 동물의 코호트를 가지고, 당신이 다르다는 가설을 테스트하기 위해 조명 / 어두운 사이클을 설정할 수 있습니다. 다양한 가벼운주기는 제 3에서 자세히 설명합니다.
3. 실험 Assays
- 검정 photoentrainment하려면 12 H 빛을 주택 마우스로 시작 : 12 H 어두운주기를. 조명 오전 오후 7시에서 7시까지에서 출발 유지하면서 정오 :이 예제는 오전 7시 - 7 시부터 불을 것입니다. 또한,주기의 12 H 조명 부분에 대한 빛의 강도를 낮추면 photoentrainment에 대한 빛의 감도에 차이를 노출합니다. 생쥐 photoentrain 2 주 주어진 가벼운 농도를 변경하기 전에.되어야합니다 (그림 2)
- photoentrainment의 추가 부분은 새로운 빛 / 어둠의 사이클을 다시 조정하거나 다시 기차에 태우다 circadian 리듬하는 능력입니다. 이 생쥐는 전기가 켜고 끌 이전 것이라는 등에 보관되어있다는 어둠 / 라이트 사이클 발전하여 검사하실 수 있습니다. 일반적으로, 빛이주기가 6시간하여 고급되며 예를 들어, 대신 오전 7시 - 7의 빛을주기 : 정오, 그것은 오전 1시 - 1이 될 것입니다 정오. 이것은 또한 빛을주기를 지연하여 검사하실 수 있습니다. 마우스는 5-7 일 이내에 일반적으로 다시 기차에 태우다 수 있습니다. (그림 3)
- 이러한 패러다임은, 그러나, 완전히 내생 circadian 시계의 기능을 평가하지 않습니다. 지속적인 어두운 조건에서 주택 생쥐도 무료로 실행 기간으로 알려진 내생 circadian 기간을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 같은 야생 유형 생쥐로 야행성 동물에서 내생 기간은 그들이 매일 조금씩 이전 바퀴에 게재되기 시작한다는 의미보다 24 시간입니다. (그림 2)이 기간의 정확한 시간은 다른 마우스 종자 간의 약간 다릅니다. BALB / CJ 생쥐에 10 22.5 시간 동안 예를 들어, C57 생쥐의 무료 운영 기간은 약 23.3 시간입니다.
- circadian 시스템에 지속적으로 어두운 조명 조건 입력에서 무료로 실행 기간을 확인 후 변화 단계를 통해 검사를하실 수 있습니다. 위상 변화는 circadian 시계를 이동하는 급성 광 펄스의 능력입니다. 지속적인 어둠 속에 보관되어 생쥐의 적극적인 단계에서이 빛의 펄스 다음 일 활동의 발병을 측정, 위상 변화는 짧은 광 펄스를 (1000lux 15 분) 관리에 의해 수행할 수 있습니다. (그림 4) 이전 연구 표시등이 11, 12를 주어진 어떤 시간에 따라 변화의 양과 방향을 설명하는 응답 곡선을 (칭했다 위상 응답 곡선) 제작했습니다. 같은 빛의 펄스는 활동의 시작 (CT20) 이후 8 시간 부여하면서 예를 들어, 15 분이 1000 럭스 빛의 펄스는 활동의 시작 (CT16) 이후 4 시간 부여하는 것은 이끌고, 활동에 2 시간 지연으로 이어질 것입니다 2 시간 사전. (그림 4)
- 휠 실행 활동 빛의 직접적인 영향을 테스트하려면, 가벼운 펄스가 활성 / 어두운 단계에서 마우스로 관리하실 수 있습니다. 이 시간에 빛의 존재는 바퀴 실행 활동을 억제합니다. 이 광 펄스의 길이가 다를 수 있지만, 우리는 어두운 단계의 시작 후 2 시간부터 3 시간 펄스가 가장 유익한 것으로 나타났습니다. (8 H 어두운주기 빛의 펄스의 관리 이전에 일주 : 어떤 경우에는 그림 5)는 이전 테스트 활동을 통합하는 데 유용할 수 있습니다, 당신은 쉽게 16 H 조명이 빛을주기를 변경하여이 작업을 수행할 수 있습니다.
- 빛을 직접 활동을 실행하는 바퀴의 억제는 ultradian (T7) 조명 사이클 13를 사용하여 circadian주기의 모든 단계에서 검사를하실 수 있습니다. 일주 13 기간 동안 3.5 H의 어두운이주기 3.5h 빛의 구성되어 있습니다. 마우스는 광 펄스이 1 주 치료 과정에 걸쳐 circadian주기의 모든 시점에서 가을 있도록 photoentrain 수 없습니다. (그림 6)
- 상수 어두운 조건과 마찬가지로, 지속적인 조명의 주택 마우스는 특성을 무료로 실행 기간을 확인할 수 있습니다. 그러나,이 기간 지속적인 어둠에있는 기간이 초과됩니다. 지속적인 조명의 무료 운영 기간의 길이는 긍정적으로 빛의 강도 14 상관이며 빛의 증가의 양이 너무 무료 운영 기간 길이를 않고. (그림 7) 단, 마우스는 거의 26시간 이상의 기간을 표시하지 않습니다. 대신, 밝은 빛 아래에서, 그들의 활동 arrhythmic 될 것입니다. 이런 이유로, 그것은 당신이 일정한 빛을 기간 길이를 비교하려는 경우 빛의 강도가 중요한 고려 사항입니다.
- 어떤 순서 이러한 빛의 perturbations을 수행하기 위해 결정하면, 그 이전에 빛을주기는 circadian 리듬에 영향을 미칠 수 기억 해요. 이러한 이유로, 그것은 먼저 mildest 치료를 시작하고 점차적으로 더 심각한 라이트 트리 트먼트로 이동하는 것이 좋습니다. 예를 들어, photoentrainment의 assays, 지속적인 어두운, 그리고 위상 교대는 매우 온화한하고 오래 지속 효과로 이어질 것하지 않습니다. 반면에, T7주기 및 지속 조명은 매우 거친 가벼운 치료하고 부정맥을 초래할 수 있으며, 실험의 마지막을 위해 예약되어 있어야합니다.
4. 데이터 분석
- 휠 실행 활동이 수집 바퀴 회전의 수는 binned 주어진 기간 내에 발생합니다. 이 빈 또는 샘플링 간격은 일반적으로 10 분 거리에 있습니다. 데이터는 각각의 빈 이내 바퀴 회전 수를 보여주는 Excel 스프레드 시트에 표시할 수 있습니다. 이것은 바퀴 회전을 quantifying하고 비교를 위해 유용할 수 있습니다. 데이터는 각각의 빈에서 활동하는 금액이 히스토그램과 같은 검은 막대의 높이로 표시됩니다 의하여 actogram로 표시할 수 있습니다. (그림 2)
- 활동 발병은 predominate 활동 시합의 시작으로 정의됩니다. 정확한 매개 변수는 각 개인마다 다를 수 있지만 일반적으로, 우리는 30 분 이상 지속 활동의 첫 시합을 찾습니다.
- photoentrain에 생쥐의 능력을 분석, 검토한 수있는 몇 가지 조치가 없습니다. photoentrained으로 마우스를 고려하는 데 사용되는 일반적인 방법은 마우스의 활동의 발병과 빛뿐만 아니라 어두운 단계에 국한되는 마우스의 활동의 큰 비율의 오프셋 사이에 안정적인 관계의 관찰이다.
- 어둠 / 빛이주기 위해 사전에 다시 유입에서 볼 때 어둠 / 라이트 사이클의 지연으로 다시 유입을 조사하면 오프셋 활동이 가장 유익한있는 동안 활동의 발병은 대부분의 정보를 제공합니다. 마우스는 일반적으로 완전히 다시 끌고 가다 바퀴가 자신의 6 시간 사전 또는 어두운 / 라이트 사이클의 지연에 활동을 실행하는 5~7일 가져가라. 마우스 특히 사전에 대응하여, 다시 개입을 고려하기 위해서는 활동의 발병과 오프셋의 불빛 사이에 안정적인 관계를 관찰해야합니다. 이 관계는 빛을 사이클 발전하기 전에 관찰되었고 적어도 사흘 동안 계속해야하는지와 유사해야합니다. (그림 3)
- 모두 지속적인 어두운 조명에서 지속적인 기간을 계산하려면, 활동의 onsets 2 주 동안 결정 및 회귀 라인 장착되어 있어야합니다. 지속적인 조명의 시대는 24 시간보다 커야되지만 마찬가지로 앞서 언급한, 야생 마우스 입력에 지속적인 어두운 기간은 24 시간 미만이어야합니다. (그림 2 7)
- 가벼운 펄스 다음과 같은 변화를 계산할 때, 빛이 파동 이후 전 최소한 오일과 5 일 동안 활동 onsets에 피팅 회귀 선에 의해 시작됩니다. 위상 변화의 크기를 결정하는 두 회귀 선의 차이를 계산합니다. (그림 4)
5. 대표 결과
바퀴 실행 기록을 보는 때, 당신은 각 마우스의 지속적인 실행의 몇 시간을 볼 것으로 예상한다. 마우스가 야행성이기 때문에,이 실행 또는 활성화 단계는, 어두운 / 라이트 사이클의 존재에있는 어두운 시대와 연관됩니다. 일정한 조건에서 실행되는 무료 생쥐들은 또한 자유 실행 리듬의 활성 단계를 대표하는 지속적인 활동이 제한된 기간을 것입니다. 상수 어둠에서,이 24 시간보다 짧은 지속적인 빛의 것입니다24시간보다. 활동의 시작 (CT16) 후 15 분 1000lux 빛의 펄스 4 시간 관리는이 빛의 펄스 다음 일 연기 활동 발병하게됩니다.
그림 1 : 대표 밝은 spectrums A.. 태양에 의해 만들어진 빛의 스펙트럼은 광범위하고 빛의 스펙트럼의 시각적 부분 400nm와 700nm 사이에 상대적으로 불편합니다. 파란 범위의 낮은 강도와 붉은 바이어스로 연결 적외선 범위에서 백열등 봉우리의 스펙트럼을 B.. C. 일반 형광등 전구가 눈에 "화이트"가 나타납니다 빛의 이산 봉우리로 구성되어 있습니다. D. 그러나, 주광색 형광등 전구는 높은 광범위한 스펙트럼과 이산 주파수 봉우리 있습니다. 결과는 백열 전구만큼 뜨거운 것은 아니지만 평균 형광 전구보다 광범위한 스펙트럼을 가진 광원이다.
그림 2 : Circadian photoentrainment. actogram 연속 일는 Y 축에 역모를하는 하나의 마우스 활동의 그래프이며, 시간은 X 축에 꾸몄다 있습니다. 검은 막대는 바퀴 회전의 수를 나타냅니다, 그리고 배경은 어두운 / 라이트 사이클의 표시를 제공 음영입니다. 어두운주기 : 일 1-8에서 마우스 12시 12분 빛 안에 보관되어 있습니다. 이 시간 동안 마우스는 불빛의 오프셋에서 실행 시작하고 어두운 단계로의 활동을 통합. 빛이 단계 동안 활동을 최소화합니다. 일 9, 조명은 어둠 속에서 끊임없이 마우스를 떠나 해제됩니다. 가벼운 사이클없이, 그 내생 시간에 실행하는 클럭 결과 circadian 시계에 아무 입력이 없습니다. 당신이 볼 수 있듯이, 활동을 매일 오늘 동물의 내생 시계 24 시간 미만이라고 표시를 시작합니다.
그림 3 : 다시 유입. 다시 진입의 패러다임은 뉴 라이트 사이클에 적응하기 위해 circadian 시계를 강요하거나 앞으로 또는 뒤로 빛을주기를 이동 포함. 이 예제에서, 사이클 9 일 6 시간 고급이며 다음 주 20 일 6 시간 지연. 두 상황에서 며칠은 그러나 효과가 발병 또는 오프셋 시간 중 더 발음 운동의 방향에 따라 다시 유입 풀 필요합니다.
그림 4 : Circadian 리듬이 빛을 짧은 펄스에 대한 응답으로 이동. 지속적인 어둠 속에 보관되어 A. 동물은 24 시간보다 짧은 기간 무료로 - 실행합니다. 일 6.25에서 15 분 1000 럭스 광 펄스는 활동의 시작 (CT16) 이후 4 시간이 주어집니다. 다음 날에는 활동 발병 시간의 변화가 관찰됩니다. 위상 변화는 동물의 예측 발병 시간 (이전 빛의 펄스들의 활동 결정)과 그들이 실제로 빛이 파동 다음 일 게재가 시작되는 시간에 차이가 있습니다.
생쥐에 대한 B. 위상 응답 곡선은 특정 circadian 시간에 짧은 광 펄스에 대한 응답으로 발생합니다 변화의 크기와 방향을 보여줍니다. 주관적 일 (CT0 - 12) 중 가벼운 펄스 죽은 영역이라고도 상당한 변화를 일으킬 수 없습니다. CT12 - 19에서 위상 지연은 정상 지연 CT16에서 빛의 펄스에 대한 응답으로 발생로 유도된 수 있습니다. 중부 표준시 19 ~ 24 사이의 활동 리듬은 정상 진행이 CT20에서 빛의 펄스에 대한 응답으로 발생과 빛의 펄스에 대한 응답으로 진행됩니다.
그림 5 : 휠 실행 활동을 저해하거나 야간에 빛의 펄스에 대한 응답으로 가면됩니다. 이 예제에서 빛을주기 16h 빛 : 8h 어두운 활동을 통합. 조명이 주 4 일 해제 후 3 시간 빛의 펄스는 2 시간 시작합니다. 이 기간 동안 직접 활동을 억제하기 위해 빛의 능력을 보여주는 노 휠 실행 활동에 조금있다. 활동 빛을 파동으로 이후에 다시 시작합니다.
그림 6 : T7 라이트 사이클이 circadian 사이클 전반에 걸쳐 광 펄스에 쥐를 노출하는 데 사용됩니다. T7주기 어둠의 3.5 시간 뒤에 빛의 3.5 시간으로 구성되어 있습니다. 이주기에, 마우스는 circadian 리듬을 유지하지만 그들은 또한 빛의 펄스하는 동안 바퀴를 실행하는 활동의 마스킹을 표시합니다. 빛을 동안 활동의 금액은 circadian 시간에 편견되지 마스킹의 측정에 대한 어두운 동안 활동의 양을 비교할 수 있습니다.
그림 7 : 지속적인 빛을 길어 기간
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Discussion
Circadian 리듬은 측정 역사에 걸쳐 다양한 생물에 기록되었습니다. 우리가 구체적으로 마우스의 활동 리듬을 기록하는 방법을 설명하는 동안,이 기술은 쉽게 같은 자주 circadian 연구에 사용되는 햄스터와 쥐 등 설치류의 다른 리듬을 측정하기 위해 수정할 수 있습니다. 그러나, 다른 생물에 다시 기차에 태우다에 freerunning 기간 및 시간은 달라집니다. 마우스에 그것이 24 시간 미만 동안 예를 들어, 지속적인 어둠 속에서 햄스터의 freerunning 기간은 24.0 시간입니다. 이 휠 실행 활동에 적합하지 유기체에서 작업중인 상황에서, 같은 가벼운 패러다임의 많은 그러나 다른 생리적 리듬을 바라 보았다해야 사용할 수 있습니다. 가장 유사한 법안은 일반적으로 활동입니다. 인간, 원숭이, 개와에서, 연구자들은 종종 개인의 운동의 양을 측정 actigraphy를 사용합니다. 인간, 체온과 멜라토닌의 분비는 일반적으로 측정하고 모두 변화 단계의 수 그리고 수 있습니다 circadian 리듬을 가지고 표시되었습니다 다시 기차에 태우다 15, 16.
우리는 이산 사건 이러한 생리적 리듬을 생각하지만, 그들은 꽤 연결되어 있습니다. 동물의 활동 리듬이 밀접하게 체온 리듬과 중첩과 수면 리듬의 반전 수있다. 또한, 자주 circadian 단계의 표지로 사용되는 멜라토닌의 분비는 밀접한 인간의 정상적인 수면 리듬 유사합니다. 이주기가 너무 결합한하기 때문에, 하나의 연구 정보를 제공하고 다른 사람의 결과를 예측할 수 있습니다. 예를 들어, 빛이 어두운 사이클의 어두운 부분을 밖으로하지만 활동을 실행하고 지속적인 바퀴를 보여주 NPAS2 돌연변이 생쥐는, 나중에 수면 결함 17 검사되었습니다. 이 생쥐는 감소 어둠 단계 정상 "낮잠 시간"동안 발생과 함께 적은 전체자는 발견했다.
휠 실행 활동 circadian 리듬을 검사하기 위해 상대적으로 비침습 방법을 제공합니다. 위에서 설명한 패러다임은 circadian 동작에 대한 자세한 분석을 완료하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 지속적인 어둠 속에서 photoentrainment과 주택과 같은 패러다임은 이전과 같은 수면 분석으로보다 집중 연구 circadian phenotypes의 초기 조사로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 부여 GM76430, 데이비드 루실 패커드와 재단, 그리고 알프레드 슬로언 재단의 재정 지원을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11.5 cm running wheels |  Mini Mitter |
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| Vital View Software for Data Acquisition | Mini Mitter |
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| Clock lab for data analysis | Actimetrics |
References
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