Medição Responses Luz circadianos e aguda em ratos usando Atividade Roda Executando

Abstract

Os ritmos circadianos são as funções fisiológicas que o ciclo longo de um período (cerca de-circadiano: aproximados e diem: dia) de aproximadamente 24 horas ^{1, 2.} Eles são responsáveis ​​pela cronometragem nosso sono / vigília e ciclos de secreção do hormônio. Uma vez que este tempo não é precisamente 24 horas, é sincronizado com o dia solar pela entrada de luz. Isto é realizado através da entrada fótica da retina para o núcleo supraquiasmático (SCN), que serve como o pacemaker mestre sincronizar relógios periféricos em outras regiões do cérebro e tecidos periféricos para o ciclo de luz ambiente escuro ^3-7. O alinhamento de ritmos a este ciclo de luz do ambiente escuro especial organiza eventos fisiológicos para o nicho temporal correto, que é crucial para a sobrevivência ^8. Por exemplo, os ratos dormem durante o dia e são ativos à noite. Esta capacidade de consolidar atividade ou para a parte clara ou escura do dia é referido como photoentrainment circadiano e requer entrada de luz para o relógio circadiano ^9. Atividade de ratos durante a noite é robusto particularmente na presença de uma roda de corrida. Medir este comportamento é um método minimamente invasivo, que pode ser usado para avaliar a funcionalidade do sistema circadiano, assim como a entrada de luz para este sistema. Métodos que serão abordados aqui são usados ​​para examinar o relógio circadiano, a entrada de luz para este sistema, bem como a influência direta da luz sobre o comportamento da roda em execução.

Protocol

1. Instalação de equipamentos

1. Preparação de grupos de animais é muito importante quando a criação de qualquer experimento comportamental. Para a atividade de roda em execução, todos os ratos precisam ser do sexo masculino, idade correspondente, e se possível a partir de acasalamentos entre irmãos. Idealmente ratos mais jovens, cerca de 3 meses de idade, são utilizadas para a atividade de roda em execução.
2. Antes de colocar qualquer animal sobre rodas, a sala precisa ser completamente configuração. Isto inclui a preparação de cada gaiola com uma roda, uma roda de revolução sonda, uma pequena quantidade de cama do rato no fundo de cada gaiola e comida farta e água para duas semanas.
3. Iluminação da sala é muito importante, quando a criação de roda de gaiolas em execução é importante para medir a intensidade da luz em cada gaiola para verificar se você está recebendo uma iluminação uniforme em cada gaiola. Além disso, ao escolher uma fonte de luz, procure um com um espectro amplo que abrange 450nm-650nm. Muitas empresas oferecem "luz do dia" ou "espectro" lâmpadas fluorescentes, que atendem a este critério. (Veja Figura 1)

2. Configuração da experiência

1. Ao introduzir ratos para a gaiola da roda em execução, fazê-lo em um ciclo de luz que se aproxima o ciclo de claro / escuro que antes eram alojados em.
2. Tente distribuir os ratos para melhor garantir ambientes similares para todos os grupos. Por exemplo, abster-se de agrupamento todos de um grupo de ratos em uma área particular, como uma única prateleira. Isso poderia inadvertidamente introduzir uma variável adicional.
3. Antes de fazer qualquer perturbações ciclo de luz ou medir a atividade, você deve dar ratos aproximadamente uma semana para se aclimatar à nova gaiola, e roda. Qualquer camundongos que não estão sendo executados nas rodas depois de uma semana deve ser retirado da gaiola e substituído por outro mouse.
4. Depois de ter um grupo de animais de forma estável rodando sobre rodas, você pode começar a definir os ciclos de claro / escuro para testar diferentes hipóteses. Os ciclos de luz diversos são discutidos em detalhe na parte 3.

3. Ensaios experimentais

1. Para photoentrainment ensaio, comece por ratos habitação em 12 h de luz: 12 h ciclo escuro. Um exemplo disso seria as luzes acesas das 7:00 am-7: 12:00, enquanto as luzes permanecem fora de 19:00 - 07h00. Além disso, diminuindo a intensidade da luz para a parte de luz de 12 h do ciclo vai expor as diferenças de sensibilidade à luz para photoentrainment. Ratos deve ser dada de duas semanas para photoentrain e antes de mudar intensidades de luz. (Figura 2)
2. Um aspecto adicional de photoentrainment é a capacidade de re-ajustar ou re-entrain ritmos circadianos a uma nova luz / ciclo escuro. Isso pode ser examinado com o avanço do ciclo claro / escuro que os ratos estão alojados em tais que as luzes se acendem e apagam mais cedo. Comumente, os ciclos de luz são avançados por 6 horas, por exemplo, em vez de um ciclo de luz de 7:00 am-7: 12:00, seria 01h00-1: 00pm. Isso também pode ser examinada por atrasar o ciclo de luz. Ratos são tipicamente capazes de re-entrain em 5-7 dias. (Figura 3)
3. Esses paradigmas não, no entanto, avaliar plenamente a funcionalidade do relógio circadiano endógeno. Camundongos habitação em constante escuro pode ser usado para medir o período circadiano endógeno também conhecido como o período de corrida livre. Em animais de hábitos noturnos, como ratos selvagens, o período endógeno é menos de 24 horas o que significa que eles começam a correr na roda um pouco mais cedo a cada dia. (Figura 2) O tempo exato desse período varia ligeiramente entre as cepas do mouse diferente. Por exemplo, o período livre funcionamento do C57 ratos é de aproximadamente 23,3 horas, enquanto em BALB / cJ ratos é 22,5 horas ^10.
4. Após a determinação do período de corrida livre na entrada de luz escura condições constantes para o sistema circadiano pode ser examinada através mudança de fase. Mudança de fase é a capacidade de um pulso de luz aguda para mudar o relógio circadiano. Mudança de fase pode ser realizado através da administração de um pulso de luz de curta duração (15 minutos; 1000lux) durante a fase ativa de ratos alojados em escuridão constante e medição do início da atividade nos seguintes dias este pulso de luz. (Figura 4) Estudos anteriores produziram curvas de resposta (curvas de resposta denominado de fase) que descrevem a quantidade ea direção da mudança com base no que o tempo de luz é dada ^{11, 12.} Por exemplo, um minuto 15, 1000 lux luz pulso dado quatro horas após o início de actividade (CT16) vai levar a um atraso de duas horas em atividade, enquanto o pulso de luz mesmo dado oito horas após o início de actividade (CT20) levará a um avanço de 2 horas. (Figura 4)
5. Para testar o efeito direto da luz sobre a atividade de roda em execução, um pulso de luz pode ser administrada a ratos durante a fase de escuro / ativo. A presença de luz neste momento irá inibir roda running-atividade. Embora a duração deste pulso de luz pode variar, descobrimos que um pulso de 3 horas de partida duas horas após o início da fase escura é mais informativo. (Figura 5) Em alguns casos, pode ser útil para consolidar a atividade antes deste teste, você pode facilmente fazer isso, alterando o ciclo de luz para uma luz h 16: 8 h escuro ciclo de uma semana antes da administração do pulso de luz.
6. Esta inibição da roda executando atividade diretamente pela luz podem ser examinados em todas as fases do ciclo circadiano, usando um ultradian ciclo de luz (T7) ^13. Este ciclo é composto de luz 3.5h: 3.5 h escuro para a duração de uma semana ^13. Ratos não são capazes de photoentrain permitindo que os pulsos de luz a cair em todos os pontos no ciclo circadiano ao longo do tratamento 1-semana. (Figura 6)
7. Semelhante ao constante escuro, ratos habitação em luz constante irá revelar um período livre característica em execução. No entanto, este período será mais longo do que o período encontrado na escuridão constante. A duração do período de corrida livre, à luz constante é positivamente correlacionada com a intensidade da luz ^14; como a quantidade de luz aumenta também a duração do período de corrida livre. (Figura 7) No entanto, os camundongos raramente mostram períodos superiores a 26 horas. Em vez disso, sob a luz brilhante, sua atividade se tornará arrítmicos. Por esta razão, é a intensidade da luz é uma consideração importante se você pretende comparar duração do período de luz constante.
8. Ao decidir qual a ordem para executar essas perturbações luz, lembre-se que os ciclos anteriores de luz pode afetar o ritmo circadiano. Por esta razão, é melhor começar com o mais suave primeiros tratamentos e, progressivamente, ir para tratamentos de luz mais grave. Por exemplo, ensaios photoentrainment, escuro constante, e mudanças de fase são todos muito leves e não parecem levar a efeitos duradouros. Por outro lado, o ciclo de T7 e luz constante são tratamentos de luz muito dura e pode levar à arritmia e deve ser reservado para o final do experimento.

4. Analisando os dados

1. Roda running-atividade é coletado eo número de rotações das rodas que ocorrem dentro de um determinado período de tempo binned. Este intervalo bin ou amostragem é comumente de 10 minutos. Dados podem ser exibidos em uma planilha excel que mostra o número de rotações das rodas dentro de cada bin. Isto pode ser útil para quantificar e comparar as rotações das rodas. Os dados também podem ser exibidos como um actogram qual a quantidade de atividade em cada bin é representada pela altura de uma barra preta como um histograma. (Figura 2)
2. Início de atividade é definido como o início da luta atividade predominante. Os parâmetros exatos podem variar entre cada indivíduo, mas geralmente, nós olhamos para o primeiro surto de atividade que dura mais de 30 minutos.
3. Para analisar a capacidade dos ratos para photoentrain, há várias medidas que podem ser olhado. Um método comum utilizado para considerar um mouse para ser photoentrained é a observação de uma relação estável entre o início da actividade do rato e do deslocamento da luz, assim como uma grande porcentagem de atividade do mouse se limita à fase de escuro.
4. O início de actividade proporciona o máximo de informação quando se olha para re-arrastamento a um adiantamento do ciclo claro / escuro, enquanto a atividade de deslocamento é mais informativo quando se examina reentrada aos atrasos no ciclo claro / escuro. Camundongos exame tipicamente 5-7 dias completamente re-entrain sua roda executando atividades para um avanço de 6 horas ou atraso do ciclo claro / escuro. A considerar um rato re-arrastado, particularmente em resposta a um adiantamento, você deve observar uma relação estável entre o início da atividade eo deslocamento da luz. Esta relação deve ser semelhante ao que foi observado antes do ciclo de luz antecedência e deve persistir por pelo menos três dias. (Figura 3)
5. Para calcular período em ambos luz constante escuro e constante, a inícios de atividade precisa ser determinado por 2 semanas e equipado com uma linha de regressão. Como mencionado anteriormente, em camundongos de tipo selvagem, o período em escuro constante será menos de 24 horas, enquanto o período em luz constante será maior do que 24 horas. (Figuras 2 e 7)
6. Ao calcular a mudança após um pulso de luz, começar por linhas de regressão apropriado para inícios de atividade por pelo menos 5 dias antes e cinco dias após o pulso de luz. Calcular a diferença entre essas duas linhas de regressão para determinar a magnitude do deslocamento de fase. (Figura 4)

5. Resultados representante

Ao olhar para os registros roda rodando, você deve esperar para ver várias horas de funcionamento contínuo em cada rato. Porque os ratos são noturnos, esta em execução ou fase ativa, vai se correlacionam com o período negro na presença de um ciclo de luz / escuridão. Camundongos corrida livre em condições de constante também terá esse período confinado de atividade sustentada representando a fase ativa do seu ritmo free-running. Na escuridão constante, esta será inferior a 24 horas e à luz constante,superior a 24 horas. Administração de um de 15 minutos 1000lux luz pulso 4 horas após o início da atividade (CT16) resultará em início de atividade atrasada nos dias seguintes esse pulso de luz.

Figura 1: espectros de luz Representante A.. O espectro da luz produzida pelo Sol é amplo e relativamente imparcial entre 400nm e 700nm, que é a parte visual do espectro de luz. B. O espectro de uma luz incandescente picos na faixa do infravermelho, o que leva a seu viés vermelho, com baixa intensidade na faixa azul. C. A lâmpada fluorescente comum, consiste de picos discretos de luz que irá aparecer "branco" do olho. D. No entanto, as lâmpadas fluorescentes luz do dia têm uma maior amplo espectro de frequência e picos discretos. O resultado é uma fonte de luz que não é tão quente quanto uma lâmpada incandescente, mas tem um espectro mais amplo do que uma lâmpada fluorescente média.

Figura 2: photoentrainment circadiano. O actogram é um gráfico de atividade a partir de um único mouse dias consecutivos, onde são plotados no eixo y, eo tempo é plotado no eixo-x. As barras pretas representam o número de rotações das rodas, eo fundo é sombreada para dar uma indicação do ciclo claro / escuro. Nos dias 08/01, o mouse está alojado em uma luz 12:12: ciclo escuro. Durante este tempo, o rato começa a correr no deslocamento de luzes e consolida a sua actividade para a fase escura. Durante a fase de luz, a atividade é mínima. No dia 9, as luzes são desligadas, deixando o mouse em constante escuridão. Sem um ciclo de luz, não há nenhuma entrada para o relógio circadiano, o que resulta no relógio rodando em seu tempo endógena. Como você pode ver, a atividade começa mais cedo a cada dia uma indicação de que o relógio endógeno deste animal é menos de 24 horas.

Figura 3: Re-arrastamento. Reentrada paradigmas implicar a transferência do ciclo de luz para frente ou para trás forçando o relógio circadiano para ajustar-se o ciclo de nova luz. Neste exemplo, o ciclo é avançada 6 horas no dia 9 e depois atrasou seis horas no dia 20. Em ambas as circunstâncias, vários dias são necessários para a completa re-arrastamento, no entanto, dependendo da direção do movimento, o efeito é mais pronunciado em qualquer início ou o tempo de deslocamento.

Figura 4: Os ritmos circadianos mudança em resposta a pulsos curtos de luz. Animais A. alojados em constante escuridão free-run com um período inferior a 24 horas. No Dia 8, a 15 minutos 1000-lux pulso de luz é dada 4 horas após o início da atividade (CT16). Nos dias seguintes, uma mudança no tempo de início de atividade é observado. O deslocamento de fase é a diferença de tempo do animal início previsto (determinada a partir da sua actividade antes do pulso de luz) eo tempo que eles realmente começar a correr no dia seguinte o pulso de luz.
B. A curva de resposta de fase para os ratos mostra a quantidade ea direção da mudança que irá ocorrer em resposta a um pulso de luz em breve específicos vezes circadiano. Um pulso de luz durante o dia subjetiva (CT0-12) não pode induzir uma mudança significativa, referida como a zona morta. De CT12-19, um atraso de fase pode ser induzida com o atraso de pico ocorrem em resposta a um pulso de luz em CT16. CT entre 19 e 24, o ritmo de atividade avançará em resposta a um pulso de luz com o avanço de pico ocorrem em resposta a um pulso de luz em CT20.

Figura 5: Roda running-atividade é inibida ou mascaradas em resposta a um pulso de luz durante a noite. Neste exemplo, o ciclo de luz é luz 16h: 8h escuro e consolida a atividade. Um pulso de luz de 3 horas começa a 2 horas após as luzes se apagam no dia 4. Durante este tempo, há pouca ou nenhuma atividade de roda running-mostrando a capacidade da luz para inibir diretamente a atividade. Atividade recomeça após a pulso de luz.

Figura 6: T7 ciclo de luz é usada para expor ratos a pulsos de luz em todo o ciclo circadiano. O ciclo T7 consiste de 3,5 horas de luz seguido por 3,5 horas de escuro. Neste ciclo, os camundongos manterá um ritmo circadiano, porém eles também exibirá mascaramento da atividade de roda em funcionamento durante os pulsos de luz. A quantidade de atividade durante a luz pode ser comparado à quantidade de atividade durante o escuro por uma medida de mascarar o que não é influenciada por tempo circadiano.

Figura 7: Período alongamento na luz constante

Discussion

Ritmos circadianos têm sido medidos e registrados em vários organismos ao longo da história. Embora tenhamos especificamente descrito o método para gravação de ritmos de atividade em camundongos, esta técnica pode ser facilmente modificado para medir ritmos em outros roedores, como hamsters e ratos, que são frequentemente utilizadas em estudos circadiano. No entanto, o período freerunning e tempo para re-entrain em outros organismos podem variar. Por exemplo, o período freerunning de um hamster na escuridão constante é 24,0 horas, enquanto em camundongos, é menos de 24 horas. Na circunstância, que você está trabalhando em um organismo, o que não é adequado para a atividade de roda rodando, muitos dos paradigmas mesma luz pode ser usada, no entanto, um ritmo diferente fisiológica deve ser olhado. A medida mais semelhante é a atividade em geral. Nos seres humanos, macacos e cães, os pesquisadores freqüentemente usam actigrafia, que mede a quantidade de movimento do indivíduo. Em humanos, a temperatura corporal ea secreção de melatonina também são comumente medidos e ambos foram mostrados para ter um ritmo circadiano, que é capaz de mudança de fase e capaz de re-entrain ^{15, 16.}

Enquanto nós pensamos desses ritmos fisiológicos como ocorrências discretos, eles são bastante interligadas. O ritmo de atividade de um animal pode estar intimamente sobrepostos com o ritmo da temperatura corporal e é o inverso de um ritmo de sono. Além disso, a secreção de melatonina, que é frequentemente utilizado como um marcador da fase circadiana, se assemelha ao ritmo normal do sono em humanos. Porque estes ciclos estão tão entrelaçados, o estudo de um pode informar e prever resultados de outros. Por exemplo, NPAS2 camundongos mutantes, que mostrou roda contínua execução de atividade que a parte escura de um ciclo de luz escuro, foram posteriormente examinados por defeitos do sono ^17. Estes ratos foram encontrados a dormir menos geral, com a diminuição que ocorre durante a fase escura, o "tempo da sesta" normal.

Atividade de roda execução fornece uma forma relativamente não-invasivo para examinar os ritmos circadianos. Os paradigmas descritos acima podem ser usados ​​para completar uma análise detalhada do comportamento circadiano. Além disso, os paradigmas, como photoentrainment e habitação na escuridão constante pode ser usado como um levantamento inicial de fenótipos circadianos antes de mais pesquisas concentradas, tais como análise de dormir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics