Tekerlek Koşu Aktivitesi kullanarak Fare Sirkadiyen ve Akut Işık Yanıtları Ölçüm

Abstract

Sirkadiyen ritimler fizyolojik fonksiyonları olduğunu döngüsü (sirkadiyen civarlarına: yaklaşık ve harcırah: gün) yaklaşık 24 saatlik bir süre içinde ^{1, 2.} Onlar bizim uyku / uyanıklık döngüsü ve hormon salgılanması zamanlaması açısından sorumludur. Bu zamanlama tam 24 saatlik olduğundan, gün güneş ışığı girişi ile senkronize edilir. Bu retinanın çevresel ışık karanlık döngüsü ^3-7 beyin ve periferik dokularda diğer bölgelerinde periferik saatlerini senkronize ana kalp pili olarak hizmet vermektedir suprakiazmatik nükleus (SCN) fotik giriş üzerinden yapılır. Bu çevresel ışık karanlık döngüsüne ritimleri ile uyum, hayatta ^kalma 8 için çok önemli olan doğru zamansal mihrabı, özellikle fizyolojik olaylar düzenlemektedir . Örneğin, fareler gündüzleri uyku ve geceleri aktiftir. Bu yetenek, gün ışığı veya karanlık bir kısmını ya da faaliyet pekiştirmek için sirkadiyen photoentrainment olarak adlandırılır ve ^sirkadiyen saat 9 ışık girişi gerektirir. Geceleri farelerin Aktivitesi özellikle çalışan bir tekerlek varlığı sağlam. Bu davranışı Ölçüm sirkadiyen sisteminin işlevinin yanı sıra bu sistemin ışık giriş değerlendirmek için kullanılan bir minimal invaziv bir yöntemdir. Burada ele çocuk Yöntemleri sirkadiyen saat, bu sistem ışık giriş, ışığın yanı sıra tekerlek çalışan davranışı üzerinde doğrudan etkisi incelemek için kullanılır.

Protocol

1. Ekipman Ayar

1. Herhangi bir davranışsal deney kurarken hayvan gruplarının hazırlanması çok önemlidir. Tekerlek çalışan aktivite için, tüm fareler erkek, yaş kardeş çiftleşmelerin uyumlu, ve eğer mümkünse. Yaklaşık 3 aylık İdeal genç fareler, tekerlek çalışan aktivite için kullanılmaktadır.
2. Tekerlekler üzerinde herhangi bir hayvan yerleştirmeden önce, oda tamamen kurulum gerekir. Bu kafes, 1 bıçak, 1 tekerlek devrim probu, her bir kafes ve 2 hafta boyunca bol bol yiyecek ve su altındaki küçük bir miktar fare yatak her hazırlanıyor içerir.
3. Tekerlek çalışan kafesleri kurarken Oda aydınlatması, her kafes bile aydınlatma olduğunu doğrulamak için her kafes ışık yoğunluğunu ölçmek için önemlidir, son derece önemlidir. Ayrıca, bir ışık kaynağı seçerken, 450nm-650nm kapsayan geniş bir yelpazede bir bakın. Birçok şirket bu kriteri karşılamak "gün ışığı" ya da "tam spektrumlu" floresan ampuller, sunuyoruz. (Bakınız Şekil 1)

2. Deney Kurulumu

1. Tekerlek çalışan kafesine fareler tanıtan, daha önce altında ev sahipliği aydınlık / karanlık döngüsü yakından eşleşen bir ışık döngüsü içinde bunu.
2. Eşit olarak tüm gruplar için benzer ortamlarda daha iyi sağlamak için fareleri dağıtmak için deneyin. Örneğin, belirli bir alanda tek bir raf olarak farelerin bir grup tüm kümeleme kaçınmalıdır. Bu ek bir değişken yanlışlıkla getirebilir.
3. Herhangi bir ışık döngüsü tedirginlikler veya aktivitesini ölçmek önce, fareler, yaklaşık bir hafta, yeni kafes gelmesini ve tekerlek vermelidir. , Bir hafta sonra tekerlekler üzerinde çalışmıyorsa herhangi bir farelerin, kafes kaldırılır ve başka bir fare ile değiştirilmesi gerekir.
4. Bir kez stably tekerlekler üzerinde çalışan hayvanlar bir kohort, farklı hipotezleri test etmek için ışık / karanlık döngüsü kurmak başlayabilirsiniz. Çeşitli ışık döngüleri part 3 ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

3. Deneysel Tahliller

1. Tahlil photoentrainment için 12 saat ışık konut fareler tarafından başlatın: 12 saat karanlık döngüsü. 12:00:: 19:00-07:00 ışıkları devre dışı kalırken, bu bir örnek, 7:00 am-7 ışıklar olacaktır. Ayrıca, 12 saat ışık döngüsü bölümü için ışık yoğunluğunu azaltmak için ışık hassasiyeti photoentrainment herhangi bir farklılık gösterecektir. Fare photoentrain iki hafta verilen ve değişen ışık şiddetlerinde önce olmalıdır (Şekil 2)
2. Photoentrainment ek bir yönü, yeni bir ışık / karanlık döngüsünü yeniden ayarlamak veya yeniden sürüklemek sirkadiyen ritimleri yeteneğidir. Bu fareler ışıkları açın ve kapalı erken olacağı gibi yerleştirilmiştir aydınlık / karanlık döngüsü ilerleyen tarafından incelenebilir. Genellikle, hafif döngülerini 6 saat ileri; örneğin, 7:00 am-7 yerine hafif bir döngü: 12:00, 01:00-1 olacaktır: 12:00. Bu aynı zamanda ışık döngüsü geciktirerek incelenebilir. Fareler genellikle 5-7 gün içinde yeniden sürüklemek mümkün. (Şekil 3)
3. Bu paradigmalar, ancak, tam endojen sirkadiyen saat işlevselliğini değerlendirmek yok. Sürekli karanlık ortamlarda Konut fareler, serbest çalışma dönemi olarak da bilinen endojen sirkadiyen süresini ölçmek için kullanılabilir. , Gibi vahşi tip fareler gibi gece hayvanlarda endojen süresi 24 saatten az onlar tekerlek üzerinde her gün biraz daha erken yayınlanmaya başlaması anlamına gelir. (Şekil 2) Bu süre tam zamanı biraz farklı fare suşları arasında değişir. Örneğin, BALB / CJ fareler ¹⁰ 22.5 saat iken C57 farelerin serbest çalışma süresi yaklaşık olarak 23.3 saattir.
4. Sirkadiyen sistemi sürekli karanlık koşullarda ışık girişi serbest çalışma süresi belirlendikten sonra faz kayması yoluyla incelenebilir. Faz kayması sirkadiyen saat vardiya akut bir ışık darbe yeteneğidir. Sürekli karanlıkta ev sahipliği farelerin aktif aşamasında ve bu ışık nabız takip eden günlerde etkinlik başlangıcı ölçüm; Faz kayması (1000lux 15 dakika) kısa bir ışık darbe verilerek başarılı olabilir. (Şekil 4) Önceki çalışmalar ^{ışığı, 11,} 12 ne zaman verilir dayalı kayması miktarı ve yönünü açıklamak yanıt eğrileri (faz yanıt eğrileri olarak adlandırılır) üretmiştir . Aynı ışık darbe faaliyet start (CT20) 8 saat sonra verilen Örneğin, bir 15 dakika, 1000 lux ışık darbe faaliyet start (CT16) sonra 4 saat yol açacak, aktivite 2 saatlik bir gecikmeye neden olacaktır 2 saat önceden. (Şekil 4)
5. Tekerlek çalışan aktivitesi üzerine doğrudan ışık etkisini test etmek için, hafif bir darbe, aktif / koyu aşamasında farelere uygulanan olabilir. Şu anda ışık varlığı tekerlek çalışan aktivitesini inhibe. Bu hafif bir darbe uzunluğu değişir, biz karanlık faz başladıktan sonra 2 saat 3 saat darbe en bilgilendirici olduğunu buldular. (8 saat karanlık döngüsü hafif darbe yönetiminin bir hafta önce: Şekil 5) Bazı durumlarda, bu test öncesinde etkinliğini pekiştirmek için faydalı olabilir, kolayca bu ışık döngüsü 16 saat ışık değiştirerek bunu yapabilirsiniz.
6. Tekerlek Bu inhibisyon ışık tarafından doğrudan faaliyet çalışan bir ultradian (T7) ışık döngüsü ¹³ ile sirkadiyen döngüsünün tüm aşamaları kontrol edilebilir. 3,5 saat karanlıkta 1 hafta ¹³ süresi: 3.5 Saat ışık Bu döngü oluşur. Fare ışık darbeleri sirkadiyen döngü bu 1 haftalık tedavi boyunca her noktasına düşmesine izin photoentrain mümkün değildir. (Şekil 6)
7. Sürekli karanlık koşullarda benzer şekilde, sabit ışık konut fareler karakteristik bir serbest çalışma süresi ortaya çıkacaktır. Ancak bu süre, sürekli karanlıkta bulunan süresinden daha uzun olacaktır. Sabit ışık serbest çalışan dönemin uzunluğu, ışık ^yoğunluğu 14 ile pozitif korelasyon; miktarda ışık artar, böylece serbest çalışma süresi uzunluğu gibi. (Şekil 7) Ancak, fare nadiren 26 saatten fazla süreler göstermektedir. Bunun yerine, parlak ışık altında, kendi faaliyet aritmik olacak. Bu nedenle, sabit ışık dönem uzunluğu karşılaştırmak için planlıyorsanız ışık yoğunluğu önemli bir husustur.
8. Bu ışık tedirginlikler siparişi gerçekleştirmek için karar verirken, önce bu ışık döngüleri sirkadiyen ritimleri etkileyebilir unutmayın. Bu nedenle, ilk önce hafif tedaviler ile başlar ve giderek daha şiddetli ışık tedavileri taşımak için en iyisidir. Örneğin, photoentrainment deneyleri, sürekli karanlık, ve faz kaymaları çok hafif ve uzun süreli etkilere yol görünmüyor. Öte yandan, T7 döngüsü ve sabit ışık çok sert ışık tedavileri ve aritmiye yol açabilir ve deney sonu için ayrılmış olmalıdır.

4. Veri analizi

1. Tekerlek çalışan faaliyet toplanan ve tekerlek devrimler sayısı binned verilen bir süre içinde meydana gelen. Bu bin veya örnekleme aralığı, genellikle 10 dakika. Veri içinde tekerlek devrimlerin her bin sayısını gösteren bir excel tablo görüntülenebilir. Bu tekerlek devrimleri ve niceleme karşılaştırmak için yararlı olabilir. Veriler de her bin aktivite miktarını bir histogram gibi bir siyah çubuk yüksekliği temsil eden bir actogram olarak görüntülenebilir. (Şekil 2)
2. Aktivite başlangıcı, baskın faaliyet maçın başlangıç ​​olarak tanımlanır. Tam parametreleri her birey arasında değişebilir, ancak genellikle, ilk maçı 30 dakika daha uzun sürer faaliyet arar.
3. Photoentrain fareler yeteneği analiz etmek, baktım pek çok tedbirler vardır. Photoentrained bir fare dikkate kullanılan yaygın yöntem, fare faaliyet başlangıcı ve ışık gibi karanlık dönem ile sınırlı olmak büyük bir yüzdesini fare faaliyet ofset arasında istikrarlı bir ilişki gözlem.
4. Aydınlık / karanlık döngüsü avans yeniden sürüklenmesini bakarken aydınlık / karanlık döngüsü gecikmeler yeniden sürüklenmesini incelerken ofset aktivite en bilgilendirici ise faaliyet başlangıçlı olan, en çok bilgi sağlar. Fareler genellikle tamamen yeniden sürüklemek onların tekerlek 6 saat önceden veya aydınlık / karanlık döngüsü gecikme etkinlik çalıştıran 5-7 gün sürebilir. Özellikle bir ilerleme yanıt, yeniden gözenekli bir fare düşünün için, faaliyetin başlangıcı ve bir ofset ışık arasında istikrarlı bir ilişki dikkat etmelisiniz. Bu ilişki ışık döngüsü ilerlemek için önce gözlendi ve en az üç gün süreyle devam ederse ne benzer olmalıdır. (Şekil 3)
5. Hem sabit hem de karanlık ve sürekli ışık dönem hesaplamak için, faaliyet sergilenir, 2 hafta için belirlenen ve bir regresyon hattı ile donatılmış olması gerekir. Daha önce de belirtildiği gibi sabit ışık süresi 24 saatten daha fazla olacak, vahşi tip farelerde, sürekli karanlıkta süre 24 saatten daha az olacaktır. (Şekil 2 ve 7)
6. Hafif bir darbe sonrası kayma hesaplanırken, en az 5 gün önce ve 5 gün sonra hafif darbe için faaliyet sergilenir uydurma regresyon hatları ile başlar. Faz kayması büyüklüğünü belirlemek için bu iki regresyon çizgisi arasındaki farkı hesaplayın. (Şekil 4)

5. Temsilcisi Sonuçlar

Tekerlek çalışan kayıtları bakarken birkaç saat sürekli çalışan, her bir fare görmek için beklemek gerekir. Fareler noktürnal olduğundan, bu çalışma, ya da aktif faza, bu karanlık dönemin karanlık / aydınlık döngüsünün varlığı ile korele. Sabit koşullarda çalışan ücretsiz fare, aynı zamanda, serbest çalışan ritim aktif faza temsil sürekli aktivite bu sınırlı süre olacaktır. Sürekli karanlıkta, bu, 24 saatten daha kısa ve sabit ışık olacak24 saatten daha fazladır. Faaliyet başlangıçlı (CT16) 15 dakika sonra bir 1000lux ışık darbe 4 saat İdaresi bu ışık nabız takip eden gün gecikmeli aktivite başlangıcı neden olacaktır.

Şekil 1: A. Temsilcisi ışık spektrumları. Güneş tarafından üretilen ışık tayfının 400nm ve 700nm arasındaki ışık tayfının görsel kısmını nispeten geniş ve tarafsız. B. kızılötesi aralığı, düşük yoğunluklu mavi aralığında, kırmızı önyargı neden bir akkor ışık zirvelerinden spektrum. C. tipik bir floresan ampul, "beyaz" gözle görünür ışık ayrık zirvelerinden oluşmaktadır. D. Ancak, gün ışığı, floresan ampuller yüksek geniş spektrumlu ve ayrık frekans zirveleri var. Sonuç olarak, akkor ampul gibi sıcak değil ama ortalama bir floresan ampul daha geniş bir spektrumu vardır bir ışık kaynağıdır.

Şekil 2: Sirkadiyen photoentrainment. Actogram gün üst üste y ekseni üzerinde çizilen tek bir fare faaliyet bir grafik ve zaman x-ekseni üzerinde çizilir. Siyah çubuklar tekerlekli devrimler sayısını temsil eder ve arka plan, açık / koyu döngüsünün bir fikir vermesi için gölgeli. Karanlık döngüsü: günde 1-8 fare 12:12 ışığında ev sahipliği yapmaktadır. Bu süre zarfında, fare, ışıklar, ofset çalışmaya başlar ve karanlık faz faaliyet birleştirir. Işık aşamasında, aktivite minimal düzeydedir. 9 gün, ışıklar sürekli karanlıkta fare bırakarak, kapalı bulunmaktadır. Endojen zaman çalışan saat sonuçlar sirkadiyen saat, bir ışık döngüsü olmadan, herhangi bir giriş var. Gördüğünüz gibi, etkinlik, her gün daha önce bu hayvanın endojen saat, 24 saatten daha az olduğunun bir göstergesidir başlar.

Şekil 3: Re-sürüklenmesini. Re-sürüklenmesini paradigmalar zorlayarak yeni bir ışık döngüsüne ayarlamak için gündelik saatin ileri veya geri ışık döngüsü değişen içerir. Bu örnekte, döngü Gün 9 6 saat ileri ve 20 gün sonra 6 saat gecikmeli. Her iki durumlarda, birkaç gün, ancak başlangıcı veya öteleme süresi ya da etkisi daha belirgindir hareket yönüne göre tam yeniden sürüklenmesini için gereklidir.

Şekil 4: Sirkadiyen ritimleri kısa ışık darbeleri yanıt vardiya. A. sürekli karanlığın içinde yer Hayvanlar 24 saatten daha kısa bir süre serbest çalıştırın. Gün 8, 15 dakikalık 1000 lux ışık darbe faaliyetin başlangıcı (CT16) 4 saat sonra verilir. Şu günlerde, faaliyet başlangıç ​​zamanı bir kayma görülmektedir. Faz kayması hayvan öngörülen başlangıç ​​zamanı (ışık darbe öncesinde faaliyet belirlenen) ve aslında hafif nabız takip eden günlerde yayınlanmaya başlaması zaman farkı.
B. fareler için faz yanıt eğrisi, belirli sirkadiyen zaman kısa bir ışık darbe yanıt olarak meydana gelecektir kayması miktarı ve yönünü gösterir. Öznel gün boyunca hafif bir darbe (CT0 12), ölü bölge olarak adlandırılır önemli bir değişim neden olamaz. CT12-19, hafif bir darbe tepki olarak ortaya çıkan pik gecikme CT16 bir faz gecikme ile uyarılabilir. CT 19 ve 24 yılları arasında, hafif bir darbe tepki olarak ortaya çıkan pik önceden CT20 faaliyet ritmi ile hafif bir darbe yanıt olarak ilerleyecektir.

Şekil 5: Tekerlek çalışan aktivitesini inhibe veya geceleri hafif bir darbe tepki olarak maskelenir. Bu örnekte, ışık döngüsü 16h ışık: 8 saat karanlık ve aktivite birleştirir. 4. Gün ışıkları kapatıp gittikten sonra 3 saat ışık nabız 2 saat başlar. Bu süre zarfında, ışık doğrudan aktivitesini inhibe etme yeteneğini gösteren hiçbir tekerlek çalışan aktivite için çok az var. Aktivitesi hafif darbe sonrasında devam eder.

Şekil 6: T7 ışık döngüsü, sirkadiyen döngüsü boyunca ışık darbeleri fareler ortaya çıkarmak için kullanılır . T7 döngüsü karanlıkta 3.5 saat 3.5 saat ışık oluşur. Bu döngüde, fare, sirkadiyen ritim koruyacaktır ancak onlar da ışık darbeleri sırasında tekerlek çalışan aktivite maskeleme gösterecektir. Işık sırasında aktivite miktarı sirkadiyen zaman önyargılı değildir maskeleme ölçmek için karanlık sırasında aktivite miktarı ile mukayese edilebilir.

Şekil 7: sabit ışık uzatma Dönemi

Discussion

Sirkadiyen ritimler ölçülür ve tarih boyunca çeşitli organizmaların kaydedildi. Özellikle farelerde faaliyet ritimleri kaydetmek için yöntem tarif ederken, bu tekniği kolayca sık sık sirkadiyen çalışmalarda kullanılan hamster ve fare gibi kemirgenlerde ritimleri ölçmek için modifiye edilebilir. Ancak, diğer organizmalar yeniden sürüklemek Neseli Bebekler Reklam dönemi ve zaman değişecektir. Farelerde Örneğin, 24 saatten az ise sürekli karanlıkta bir hamster Neseli Bebekler Reklam süresi, 24.0 saat. Tekerlek çalışan faaliyeti için uygun olmayan bir organizma, çalışma koşul, aynı ışık paradigmaların çoğu, ancak farklı bir fizyolojik ritmine baktı olmalıdır, kullanılan olabilir. En benzer bir tedbir genel bir faaliyettir. Insanlar, maymunlar ve köpekler, araştırmacılar genellikle bireyin hareketinin miktarını ölçer actigraphy kullanın. İnsanlarda vücut ısısı ve melatonin salgılanması da yaygın olarak ölçülür ve her ikisi de faz kayması yeteneğine sahip ve yetenekli bir sirkadiyen ritim, sahip olduğu gösterilmiştir yeniden sürüklemek ^{15, 16.}

Ayrık olaylar olarak bu fizyolojik ritimlerin düşünürken, onlar oldukça birbirine bağlıdır. Faaliyet ritmi bir hayvanın vücut ısısı ritmi ile yakından üst üste ve bir uyku ritmine ters olabilir. Ayrıca, sık sık sirkadiyen faz bir marker olarak kullanılan melatonin salgılanması, insanlarda normal uyku ritmi yakından benzemektedir. Bu döngüleri iç içe olduğundan, bir çalışma bilgilendirmek ve başkalarının sonuçları tahmin edebilirsiniz. Örneğin, sürekli tekerlek, bir ışık, karanlık döngüsünün karanlık bir kısmı dışarı rağmen faaliyet gösterdi NPAS2 Mutant fareler, ^daha sonra uyku kusurları 17 incelendi. Bu fareler, karanlık safhası, normal "şekerleme zaman" sırasında meydana gelen düşüş, daha az genel uyku bulundu.

Tekerlek çalışan aktivite sirkadiyen ritimleri incelemek için nispeten non-invaziv bir şekilde sağlar. Yukarıda açıklanan paradigmalar sirkadiyen davranış ayrıntılı bir analiz tamamlamak için kullanılabilir. Ayrıca, sürekli karanlıkta photoentrainment ve konut gibi paradigmalar ilk önce uyku analizi gibi daha yoğun bir araştırma sirkadiyen fenotipleri bir anket olarak kullanılan olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics