Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

1. Preparação da Área Operacional

1. A superfície de operação é o primeiro preparado por desinfecção da área com álcool 70%.
2. Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados com um esterilizador quente talão antes da cirurgia (e entre cirurgias rato individual). Estes instrumentos incluem: tesoura cirúrgica (2), fórceps (1), fórceps curvos (1), porta-agulha (2), e um rectractor peito.
3. Gaze de algodão e aplicadores devem estar disponíveis, a fim de gerenciar a hemorragia.
4. Ajustar a temperatura de um sistema de cobertor homeotérmicos (almofada de aquecimento), a ser usado para manter a temperatura corporal do animal a 37 ± 1 ° C, a fim de evitar uma queda drástica da temperatura corporal; o tamanho de um infarto depende a duração da oclusão como a temperatura do corpo também (Tarnavski et al.).
5. Antes da anestesia, cada animal receberá uma dose de buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ) e comprimidos orais carprofeno (Rimadyl, Bioserv comprimido; 1 comprimido) no dia anterior à cirurgia. No momento imediatamente anterior à cirurgia, cada animal vai novamente receber uma dose de buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ).
6. Nota: Para os estudos envolvendo a avaliação da função cardíaca e remodelamento cardíaco durante um período de tempo (7 - 28 dias e além), uma dose de buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ) será administrada, a cada 6 horas após a cirurgia por 24-48 horas após a cirurgia e carprofeno comprimidos orais serão fornecidas uma vez ao dia (ver "recuperação pós-operatória").

2. Preparação e intubação de Ratos

1. Antes da indução da anestesia, os animais serão examinados para identificar quaisquer condições pré-existentes que podem complicar o resultado cirúrgico; exame físico irá incluir a inspecção visual e medição da freqüência cardíaca, freqüência respiratória e temperatura corporal e peso corporal.
2. Se os animais estão determinados a ser saudável, 250-300 gramas ratos machos (eg Sprague Dawley) serão pesados ​​e características de identificação serão gravados.
3. Ratos são, então, anestesiados com 80 mg / kg de pentobarbital, o nível correto de anestesia é verificada através da resposta a retirada do membro, aplicando pressão do leito ungueal rato (tep pinch-reflex) e periodicamente durante todo o procedimento.
4. Buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg; SQ) será administrado no momento da cirurgia.
5. Um barbeador elétrico é então usada para raspar o pêlo forma as áreas do pescoço e no peito. Nota: Para os estudos envolvendo a avaliação da função cardíaca e remodelamento cardíaco durante um período de tempo (7 - 28 dias e além), a pele deve estar completamente raspada longe da área cirúrgica para manter a esterilidade.
6. As áreas devem ser raspadas limpo e desinfetado com solução de betadine seguido por limpar a área com álcool 70%; este betadine e esfregar álcool e procedimento de desinfecção deve ser repetido três vezes.
7. O animal anestesiado é então colocado em posição supina em um sistema de cobertor homeotérmicos (almofada de aquecimento), a fim de manter a temperatura corporal.
8. Entubação endotraqueal é então realizada pela primeira cuidadosamente expondo a traquéia, para melhorar a visualização de intubação, fazendo uma incisão 5 milímetros mid-pescoço e retração do tecido muscular, logo acima da traquéia.
9. Isto permite melhor visualização para inserção do tubo endotraqueal (tamanho de polietileno 90; PE 90), onde a tubulação é chanfrado na borda para facilitar a entrada através da laringe.
10. O tubo endotraqueal é inserido na traquéia, com visualização ajudado usando um microscópio estéreo cirúrgico, com cuidado manipular a língua durante a visualização da traquéia e na entrada do tubo endotraqueal.
11. Ventilação mecânica é então obtida, ligando o tubo endotraqueal a Kent Científico ventilador (TOPO Dual Mode) de ciclismo a 80 respirações por minuto e um volume corrente de 1,2 ml por 100 gramas de peso corporal.
12. A cortina estéril é então colocada sobre o rato, deixando apenas a área cirúrgica expostos, minimizando assim possível contaminação durante a operação.
13. O cirurgião animal e assistentes estão a usar máscara, avental e luvas; com luvas sejam alteradas entre as cirurgias de ratos individual.

3. Transitória Esquerda ligadura da artéria descendente anterior (LAD)

1. Uma vez que a respiração estável é estabelecida, o tórax é aberto no quarto espaço intercostal esquerdo, usando hemostats ou tesoura rodada final para abrir o espaço, mas sem cortar o tecido para que o risco de hemorragia pode ser reduzido.
2. Um retrator peito é então posicionado dentro do quarto espaço intercostal, a fim de difundir as costelas para que o ventrículo esquerdo (LV) é exposto, tendo o cuidado máximo para não danificar o pulmão.
3. O pericárdio é então aberta, mas deixou no local, se possível.
4. O proximal da artéria anterior esquerda (LAD) descendente serão identificados (Figura-1), com o uso de comomicroscópio estéreo urgical, eo LAD é, então, transitoriamente, ligada (ou pode ser amarrado com um nó corrediço) usando uma sutura prolene 6-0 por um período de 30 minutos de isquemia (Figura-1), mas sem exteriorização do coração.
5. Para permitir reperfusão cardíaca, tesoura microcirúrgica são usados ​​para cortar o nó na ligadura (ou liberando o slipknot), feita pelo prolene 6-0 sutura, 30 minutos após a ligadura da LAD.
6. Em ratos sham controle, o procedimento é idêntico, exceto o LAD não é transitoriamente ligada.
7. A saída é, então, brevemente (1-2 segundos) off beliscou no respirador para permitir a re-inflação dos pulmões.
8. O retrator peito é então removido e as costelas são desenhados em conjunto, utilizando uma sutura prolene 2-0 com um padrão de sutura interrompido.
9. Uma vez que as costelas estão fechadas, a saída do ventilador é novo brevemente (1-2 segundos) comprimiu fora para garantir a respiração adequada.
10. A pele é fechada com sutura prolene 6-0 com um padrão de sutura contínua.

4. Confirmação de ligadura de sucesso da Artéria LAD

1. Ligadura adequado do LAD será confirmada pela observação de branqueamento de tecido do miocárdio distal à sutura, bem como a disfunção da parede anterior, como observado durante a ligadura LAD transitória.
2. Reperfusão será verificada pelo retorno de cor vermelha para o tecido do miocárdio e da demonstração de alguma recuperação de movimento da parede anterior; como observado imediatamente após a ligadura LAD transitória.
3. Nota: Para os estudos envolvendo a avaliação da função cardíaca e remodelamento cardíaco durante um período de tempo (7 - 28 dias e além), o ecocardiograma serão realizados 24 horas ligadura LAD post, a fim de determinar a extensão do induzido infarto do miocárdio. Todos os animais com um encurtamento do ventrículo esquerdo fracionária (LV FS) <20%, determinado a partir de um ecocardiograma, assim como disfunção de movimento da parede anterior de acordo com o infarto, serão identificados e usados ​​para acompanhamento da função cardíaca e estudos de remodelação. Ratos Sham controle deverão ter um normal LV FS entre 40-45% (del Monte et al).

5. Recuperação pós-operatório

1. Uma vez que a cirurgia está completa, a cortina estéril sobre o animal será removido. A temperatura do corpo (por um termômetro retal), freqüência respiratória (por inspecção visual), freqüência cardíaca (por palpitações), e sinais de dor anormal devem ser monitorados até que o animal se torna ambulatorial.
2. O rato vai ser retirado do ventilador e, em seguida, ser colocado em uma gaiola animal e permitiu a recuperação da anestesia. Nesta gaiola, uma extremidade da gaiola vai ser aquecido por uma almofada de aquecimento para permitir que o rato para procurar calor. Além disso, a água estará disponível para o rato durante este período de observação.
3. Se sinais de desidratação são observados após a cirurgia, 0,5 ml de solução salina estéril será injetada por via intraperitoneal (IP).
4. Buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg; SQ), então, ser administrado imediatamente após a cirurgia, e durante a recuperação pós-operatória.
5. Nota: Para os estudos envolvendo a avaliação da função cardíaca e remodelamento cardíaco durante um período de tempo (7 - 28 dias e além), uma dose de buprenorfina (0,1-2,5 mg / kg SQ) será administrada, a cada 6 horas após a cirurgia por 24-48 horas após a cirurgia. Carprofeno comprimidos oral (Rimadyl, Bioserv comprimido) também será fornecido (1-comprimido por dia) durante pelo menos 48 horas após a cirurgia.

6. Avaliação histológica da Reperfusão Isquemia

1. Após a conclusão do período de reperfusão de 4 horas, os ratos serão anestesiados novamente com 80 mg / kg de pentobarbital e da LAD é ligada, mais uma vez (ou o slipknot pode ser retied) (Huang et al e Kaiser et al).
2. 1 ml de 5% de Evan Blue (em tampão fosfato) é injetado na câmara ventricular direita e permitiu a perfundir por 2 minutos.
3. Depois de 2 minutos, 1 ml de solução de cloreto de potássio saturado é então injetado na câmara ventricular direita, a fim de parar o coração de bater.
4. O coração é então rapidamente extirpado, embutidos em 2% agarose tampão fosfato, e em seguida seccionados em fatias de 1-2 mm.
5. O miocárdio viável é, então, corados com o cloreto de tetrazólio 2% trifenil (TTC) por 20 minutos e imagens de cada fatia é capturado. As imagens são então quantificados de modo a identificar a quantidade de área do miocárdio: (1) que não em risco é (seções azul), (2)-área de risco (AAR, vermelho e branco seções), e (3 ) área que está infartada (branco "imaculada" seções) (Figura-2).

7. Resultados representante

Para estudos envolvendo a avaliação do tamanho do infarto e da área em risco (AAR), pelo corante azul de Evan e cloreto de trifenil tetrazólio (TTC), após 4 horas de reperfusão, ligadura adequado do LAD pode ser confirmadoobservando branqueamento de tecido do miocárdio distal à sutura, bem como a disfunção da parede anterior, como observado durante a ligadura LAD transitória. Reperfusão pode ser verificado pelo retorno de cor vermelha para o tecido do miocárdio e da demonstração de alguma recuperação de movimento da parede anterior; observado imediatamente após a ligadura LAD transitória. Para estudos envolvendo a avaliação da função cardíaca e remodelamento cardíaco durante um período de tempo (7 - 28 - dias e além), ligadura apropriada da isquemia seguida de reperfusão também pode ser confirmada pelo branqueamento dos tecidos, disfunção da parede anterior eo retorno da cor vermelha, com alguma recuperação do movimento da parede após a reperfusão. Além disso, a função cardíaca prejudicada pode ser determinada por um ecocardiograma sendo realizada 24 horas pós ligadura LAD, a fim de determinar a extensão do infarto do miocárdio induzido. Todos os animais com um encurtamento do ventrículo esquerdo fracionária (LV FS) <20%, determinado a partir de um ecocardiograma, assim como disfunção de movimento da parede anterior de acordo com o infarto, serão identificados e usados ​​para acompanhamento da função cardíaca e estudos de remodelação. Ratos Sham controle deverão ter um normal LV FS entre 40-45% (del Monte).

Figura 1. Diagrama esquemático de um infarto do miocárdio e Ligadura LAD. Diagrama esquemático de (1) enfarte do miocárdio e (2) ligadura da anterior ventricular esquerda descendente anterior (ADA) da artéria utilizando uma sutura, utilizado para simular o infarto do miocárdio causadas pela formação de praga.

Figura 2. Imagem Representante de um coração de rato após IAM. Imagem representativa do coração de rato mostrando a área em azul (área de não-perfusão coronária obstruída), área em vermelho área de perfusão (oclusão coronária indicando a área em risco (AAR) de infarto, e área em branco / amarelo zona (infarto dentro da AAR).

Infarto agudo do miocárdio (IAM) em ratos, também conhecido como isquemia-reperfusão (IR), é comumente usado para imitar o remodelamento ventricular humana que levam à insuficiência cardíaca. A progressão da disfunção ventricular esquerda e insuficiência cardíaca em modelos animais (ratos e camundongos) é semelhante à observada em humanos que sustentam um MI, sobreviver e posteriormente desenvolve insuficiência cardíaca (Goldman). Este procedimento descrito uma versão desta técnica e também continha notas adicionais descrevendo variações metodológicas. Adicionais tais variações para o infarto agudo do miocárdio procedimento (AMI) incluem a duração da isquemia ea duração de reperfusão. Além disso, há variações em relação ao procedimento cirúrgico utilizado para ganhar acesso e ligar o LAD. Em relação à duração do período de isquemia, o tempo de ligadura LAD para induzir um infarto do miocárdio pode ser restringida de forma aguda (30 minutos para 60 minutos; IAM) ou, alternativamente, restrito cronicamente (permanente; MI). No que diz respeito à duração de reperfusão após esse período inicial de isquemia antes da avaliação do miocárdio (ou seja, o período de reperfusão subseqüente), pode ser curto (de 4 horas para 24 horas), a fim de avaliar o tamanho do infarto e da área em risco (AAR ) pelo corante azul de Evan e cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) ou, alternativamente, prolongado (7 dias a 28 dias e além), a fim de avaliar a função cardíaca e remodelação. Esta remodelação cardíaca patológica (apoptose, necrose e disfunção do VE) pode variar dependendo da duração escolhida de isquemia e reperfusão. Como uma alternativa ao procedimento cirúrgico minimamente de expor o coração, a fim de ligadura do LAD dentro do quarto espaço intercostal e sem exteriorização do coração (ver Capítulo 3: Transient esquerda Anterior ligadura da artéria descendente anterior (ADA)), uma incisão através do osso esterno , para criar um maior acesso e vista para o coração, pode ser realizada. Resumidamente, é feita uma incisão através da pele do tórax ventral até meados do tórax após o qual o tórax é aberto ao esterno-mid. Este toracotomia parcial é seguida por retração das bordas do esterno com uma válvula. A artéria LAD proximal é, então, identificados, com o uso de um microscópio cirúrgico e, ou transitoriamente ligada (ou pode ser amarrado com um nó corrediço) usando uma sutura prolene 6-0 por um período de 30 minutos isquêmico (IAM) ou permanentemente ligados usando uma sutura 6-0, prolene (MI). Para AMI procedimentos, tesoura microcirúrgica será usado para cortar o nó na ligadura de 30 minutos após a ligadura LAD. A saída é, então, brevemente (1-2 segundos) off beliscou no respirador para permitir a re-inflação dos pulmões. O retrator é removido e as costelas são reunidos e suturada com prolene 2-0 com um padrão de sutura interrompido. Uma vez que o peito está fechado, a saída é brevemente comprimiu fora novamente para garantir a respiração adequada e que a pele é fechada com prolene 6-0 com um padrão de sutura contínua. No geral, o infarto agudo do miocárdio modelo animal (AMI) descritas neste protocolo imita a doença isquêmica do coração humano e serve como uma ferramenta importante para ajudar a elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na sinalização de remodelação cardíaca e insuficiência cardíaca.