The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Department of Veterinary Science, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 3Present address: Department of Pulmonary Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, MI
Holmes, K. E., Wyatt, M. J., Shen, Y., Thompson, D. A., Barald, K. F. Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (47), e2466, doi:10.3791/2466 (2011).
हाल के वर्षों में, electroporation आंख, मस्तिष्क, और zebrafish के somites सहित विभिन्न ऊतकों में डीएनए, शाही सेना, और morpholinos के vivo अभिकर्मक के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बन गया है. आनुवंशिक हेरफेर के अन्य तरीकों पर electroporation का लाभ यह है कि विशिष्ट ऊतकों, लक्षित किया जा सकता है spatially और अस्थायी दोनों मौजूदा बिजली के आवेदन के द्वारा अणुओं की शुरूआत के लिए. यहाँ हम zebrafish के भीतरी कान के विकास के ऊतकों में mif mif - तरह morpholinos transfecting लिए electroporation के उपयोग का वर्णन . पिछले अध्ययनों में, mif morpholino 1 पर भ्रूण में इंजेक्ट - 8 सेल चरण के लिए तंत्रिका तंत्र और आंखों में बड़े पैमाने पर morphological परिवर्तन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कान में हुई. भीतरी कान के विकास में बाद के चरणों में ऊतकों को लक्षित करके, हम विकासशील भीतरी कान में MIF के प्राथमिक प्रभावों का निर्धारण, माध्यमिक प्रभाव है कि अन्य ऊतकों के प्रभाव से परिणाम हो सकता है के लिए विरोध के रूप में कर सकते हैं. Phalloidin और acetylated न्यूरॉन्स, neuronal प्रक्रियाओं, और बालों के पीछे मैक्युला के साथ जुड़े कोशिकाओं की आकारिकी अध्ययन धुंधला ट्यूबिलिन का उपयोग करके, हम zebrafish भीतरी कान में लक्षित अभिकर्मक के लिए एक विधि के रूप में electroporation की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में सक्षम थे. 24hpf भ्रूण के कान vesicles morpholinos और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे और फिर भ्रूण कि कोई उपचार प्राप्त था या केवल एक या इंजेक्शन गया electroporated की तुलना में. भ्रूण कि इंजेक्शन थे और electroporated बाल सेल संख्या में कमी देखी गई, statoacoustic नाड़ीग्रन्थि (शिथिलता) और नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में कम शिथिलता न्यूरॉन्स द्वारा innervation की कमी हुई. हमारे नतीजे बताते हैं कि बाद के चरणों में otocysts में morpholinos के प्रत्यक्ष वितरण गैर विशिष्ट तंत्रिका तंत्र और 1-8 सेल स्तर पर वितरित morpholinos के तंत्रिका शिखा प्रभाव से बचा जाता है. यह भी अनुमति देता है कि भीतरी कान और मस्तिष्क, तंत्रिका शिखा या periotic mesenchyme पर प्राथमिक प्रभाव से कान नहीं माध्यमिक प्रभाव के लिए निर्देशित कर रहे हैं प्रभाव की परीक्षा है.
1. Electroporation के लिए इलेक्ट्रोड बनाने
2. Electroporation स्टेशन सेट
3. Morpholinos के Zebrafish कान पुटिका में Microinjection
4. Electroporation प्रक्रिया
5. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 electroporation स्टेशन. इलेक्ट्रोड तेज 75μm टंगस्टन तारों का उपयोग किया गया था और को सुरक्षित रखें CUY 21 वर्ग तरंग संपादित करें Electroporator की ओर जाता है से जुड़ा है. ये इलेक्ट्रोड micromanipulators टेप थे.
चित्रा 2 इंजेक्शन स्टेशन. सभी भ्रूण मानकीकरण उद्देश्यों के लिए सही कान में इंजेक्शन थे.
चित्रा 3. 3 DPF भ्रूण के साथ actin filaments के Phalloidin धुंधला हो जाना. (ए) 3 DPF भ्रूण injecteनियंत्रण एमओ के साथ घ पीछे मैक्युला (बजे) में phalloidin की मजबूत धुंधला हो जाना है. (बी) में इंजेक्शन केवल भ्रूण में भ्रूण जो नियंत्रण एमओ के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था और तब electroporated बजे phalloidin धुंधला के समान स्तर पर था. (सी) mif राज्यमंत्री के साथ कान का पुटिका में अकेले इंजेक्शन phalloidin धुंधला की कमी का कारण नहीं था, जबकि mif राज्यमंत्री electroporation के साथ इंजेक्शन phalloidin धुंधला दोपहर (डी) में एक नाटकीय कमी के कारण होता है. हूँ, पूर्वकाल मैक्युला.
चित्रा 4 5 DPF लार्वा के साथ actin filaments के Phalloidin धुंधला. इंजेक्शन के बीच कोई अंतर ही था (ए) और electroporation के साथ इंजेक्शन जब मानक नियंत्रण morpholino (बी) का इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, 5 DPF लार्वा कि mif morpholinos और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे पीछे मैक्युला (बजे) (डी) में phalloidin धुंधला हो जाना, हालांकि कम 3 DPF की तुलना में नाटकीय, जब भ्रूण है कि mif केवल morpholinos (सी इंजेक्शन के साथ किया गया था के साथ तुलना में कम दिखाया ). हूँ, पूर्वकाल मैक्युला.
5 चित्रा 3 DPF में भ्रूण के acetylated ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना. (ए) में भ्रूण किसी भी इंजेक्शन या electroporation प्राप्त नहीं किया. (बी) में भ्रूण electroporated लेकिन कोई इंजेक्शन प्राप्त किया गया था. Mif morpholinos साथ दोनों इंजेक्शन और electroporation (सी, डी) प्राप्त भ्रूण दिख था नियंत्रण की तुलना में कम ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना. (बजे, पीछे मैक्युला).
चित्रा 6 के साथ 3 नियंत्रण morpholino DPF पर भ्रूण की acetylated ट्यूबिलिन धुंधला. (ए) किसी भी उपचार के बिना भ्रूण पीछे मैक्युला (बजे) और व्यापक innervation में मजबूत acetylated ट्यूबिलिन धुंधला दिखाया. (बी) भ्रूण नियंत्रण morpholino के साथ अंतःक्षिप्त. (सी) भ्रूण केवल electroporation के साथ इलाज किया. (डी) के साथ नियंत्रण नियंत्रण morpholino भ्रूण इंजेक्शन और electroporated कोई उपचार नियंत्रण की तुलना में पीछे मैक्युला और innervation में acetylated ट्यूबिलिन के समान स्तर है.
हम सफलतापूर्वक 24 HPF zebrafish भ्रूण के कान में antisense oligonucleotide राज्यमंत्री शुरू. है कि इंजेक्शन और electroporation के बाद उठाया गया भ्रूण व्यवहार्य थे. यदि भ्रूण electroporation बच गया, वे भ्रूण कि कोई उपचार है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण कि केवल इंजेक्शन दिया गया था और भ्रूण कि केवल electroporated किया गया था प्राप्त किया था की तुलना में सामान्य दरों पर वृद्धि हुई.
हम कान इंजेक्शन और electroporation के बाद phalloidin और acetylated ट्यूबिलिन के साथ लेबलिंग के माध्यम से mif mif तरह - राज्यमंत्री के प्रभाव मनाया. पीछे मैक्युला के संवेदी बालों की कोशिकाओं में actin filaments के Phalloidin धुंधला mif mif तरह 24 HPF मंच पर एमओ की है कि electroporation इंगित करता है बाल सेल और / या stereocilia संख्या में परिवर्तन का कारण बनता है जब भ्रूण कि केवल राज्यमंत्री के साथ अंतःक्षिप्त थे की तुलना में (चित्रा 3). बाल सेल संख्या में यह कमी शेन एट अल के निष्कर्षों के साथ संगत है (प्रस्तुत). कि mif और mif की तरह राज्यमंत्री saccular मैक्युला में बालों की कोशिकाओं की संख्या में कमी का कारण है. भ्रूण कि राज्यमंत्री और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे कि electroporation प्रदर्शित में बाल सेल संख्या में कमी कोशिका झिल्ली भर में राज्यमंत्री बढ़ने में सहायता, जिससे रूपात्मक प्रभाव की हद तक जब भ्रूण जिसमें कान पुटिका ही इंजेक्ट किया गया था की तुलना में बढ़ रही हो सकता है. Statoacoustic नाड़ीग्रन्थि की आकारिकी में परिवर्तन acetylated ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना के माध्यम से मनाया गया. statoacoustic नाड़ीग्रन्थि द्वारा innervation की हद तक, भ्रूण है कि इंजेक्शन थे और electroporated शो neurites (चित्रा 5) की शाखाओं में कमी आई के रूप में प्रभावित किया गया था. वहाँ भी ganglionic कोशिकाओं और / या नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के कम संख्या के संक्षेपण कम किया जा सकता है, क्योंकि acetylated ट्यूबिलिन धुंधला भ्रूण कि दोनों अंतःक्षिप्त थे electroporated में काफी कमी आई है. क्योंकि mif तंत्रिका तंत्र के विकास (सुजुकी एट अल., 2004) के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है, electroporation के बाद देखा परिवर्तन की वृद्धि mif और mif की तरह neuroblast कोशिकाओं में एमओ समाधान. अभिकर्मक के परिणाम हो सकता है
एक विकासशील ऊतक में सीधे antisense oligo morpholinos के electroporation है कि ऊतक के विकास के दौरान भ्रूण में दोनों spatially और अस्थायी, जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. Mif और mif की तरह भीतरी कान के ऊतकों में राज्यमंत्री के electroporation दोनों पीछे मैक्युला और statoacoustic नाड़ीग्रन्थि की असामान्य आकारिकी में हुई. भ्रूण कि इंजेक्ट किया गया था और है कि कोई भी उपचार प्राप्त किया था या भ्रूण कि या तो केवल था इंजेक्शन गया या केवल electroporated के साथ भ्रूण के साथ तुलना में electroporated में पीछे मैक्युला में संवेदी बालों की कोशिकाओं की संख्या में कमी थी. वहाँ भी statoacoustic नाड़ीग्रन्थि और शिथिलता के आकार से पीछे संवेदी पैच के innervation की डिग्री में एक कमी थी. Electroporation विशिष्ट ऊतकों में बड़े अणुओं के साथ, transfecting वांछित ऊतकों में है कि विशेष रूप से डीएनए, शाही सेना, या एमओ के प्राथमिक प्रभाव देख और अन्य ऊतकों पर माध्यमिक प्रभाव से इन भेदभाव, मस्तिष्क, तंत्रिका शिखा और सहित के लाभ के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है भीतरी कान के विकास पर periotic mesenchyme (Barald और Kelley, 2004).
लेख के उत्पादन जीन उपकरण, LLC, जो वीडियो और पाठ में उल्लेख किया अभिकर्मकों उपज के द्वारा प्रायोजित किया गया था.
इस काम KFB के लिए बहरापन रिसर्च फाउंडेशन से Yc एस और NSF (0930096 IOS) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
KFB: 2 NIH / NINDCD DC04184 RO1, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newark Inc | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Co. | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon BD | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon BD | ||
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