שיטת Alternant את המודל המסורתי של נאס"א פריקה Hindlimb ב עכברים

Ferreira, J. A., Crissey, J. M., Brown, M. An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice. J. Vis. Exp. (49), e2467, doi:10.3791/2467 (2011).

מורי-הולטון hindlimb פריקה (האוניברסיטה העברית) היא שיטה מקובלת הלאומי לאווירונאוטיקה וחלל המינהל (נאס"א) קרקעיים מודל לחקר ניוון, חוסר שימוש במכרסמים ^4-6. המחקר שלנו להעריך שיטה alternant את הטכניקה זהב סטנדרטי מורי-הולטון זנב המתיחה HU בעכברים. חמישים וארבע נקבות עכברים (4-8 מו.) היו האוניברסיטה העברית במשך 14 ימים (n = 34) או 28 ימים (n = 20). השחזור HU הוערכה לאחר 3 ימים של ambulation כלוב נורמלי הבאים HU (n = 22). העכברים מתאימים גיל (n = 76) שימש נושאת משקל שולטת.

לפני HU זנב טבעת נוצרה עם חוט פלדה סטרילי 2-0 כירורגית שהועברה דרך ^ה -5, ^ה 6 או ^ה 7 בין השדרה שטח דיסק בצורת לזירה שממנה העכברים הושעו. מיקום החוליות עבור טבעת הזנב נבחר כראוי איזון משקל הגוף החי בלי להתערב עם עשיית הצרכים.

אנחנו נקבע את ההצלחה של טכניקה זו על ידי האוניברסיטה העברית רומן בהערכת משקל הגוף לפני ואחרי האוניברסיטה העברית, תואר של ניוון soleus, ו HU מסת הכליה הבאה. משקל גוף של עכברים לפני האוניברסיטה (24.3 ± 2.9g) לא ירידה משמעותית מיד לאחר 14d של האוניברסיטה העברית (22.7 ± 1.9g), 28d של האוניברסיטה העברית (21.3 + 2.1g) או לאחר התאוששות 3 ימים (24.0 ± 1.8g) . מסת שריר Soleus ירד באופן משמעותי (-39.1% ו -46.6%) בעקבות האוניברסיטה העברית במשך 14 ימים ו -28 ימים בהתאמה (p <0.001). לאחר 3 ימים של התאוששות soleus מסה משמעותית ל -74% של ערכים שליטה. משקולות הכליה של עכברים HU לא היו שונים בהשוואה לעכברים שליטה.

ההצלחה של השיטה שלנו הרומן HU מתבטא בשמירה על משקל גוף החיה, להשוות משקולות בלוטת יותרת הכליה, וניוון soleus HU הבאים, המתאים לערכים בספרות צפוי ^{2, 7, 8.} היתרונות העיקריים של שיטה זו האוניברסיטה כוללים: 1) להקל על בדיקה הזנב במהלך ההשעיה; 2) ירדה הסבירות זנבות בכחלון, מודלק, ו / או נמקי נצפו לעתים קרובות עם מקליטה זנב HU: 3) כל אפשרות של עכברים ללעוס את המתיחה הקלטת יוצא של מנגנון ההשעיה, ו 4) התאוששות מהירה ופעילות כלוב נורמלי מיד אחרי האוניברסיטה העברית.

טרום ניתוח מכשירים / חומרים

• חוט חותכי / צבת
• גזה 2 x 2 "רפידות
• כרית חימום
• מקלות כסף חנקתי
• כפפות מנתחים סטרילית
• שאיפה Isoflurane הרדמה
• Chlorhexidine gluconate 4% (לקרצף כירורגית אנטיספטי)
• פלדה סטרילי 2-0 כירורגי תפר
• 25 X 5 / 8 מחט מד (Autoclaved)
• Hemostat (Autoclaved)
• פלדה תפר כירורגי

ניתוח נוהל

1. יצירת שדה סטרילי. בצע הליך סטרילי.
2. הרדימי עכבר עם 2 - 3% isoflurane.
3. המקום העכבר על כרית חימום.
4. לשפשף עם זנב פתרון chlorhexidine.
5. אתר 5, 6, 7 או ^ה החלל חולייתי (בין שני גרמי בליטות על הזנב, מתחילים לספור מהקצה של שיער הגוף, בבסיס הזנב).
6. השתמש Hemostat ו 25 גרם מחט לעשות חור טייס בין שתי חוליות, לחלל חולייתי.
7. השתמש במספרי תיל כדי לחתוך את תפר פלדה 10 ס"מ.
8. הסר את המחט והכנס תפר פלדה דרך חור, 5 ס"מ על תפר צד של הזנב.
9. כל צד של הזנב צריך + 5 ס"מ של תפר.
10. המקום קצה האגודל על הזנב.
11. השתמש יד חופשית שלך והרוח תפר פלדה על קצה האגודל ולסובב את הקצוות כדי ליצור לולאה גדולה. החלק פצע עגול או צריך להיות + 3 מ"מ אורך.
12. הסר את האגודל.
13. קלאמפ קווצת שיער של תפר עם hemostat לבין לכופף אותו לתוך לולאה קטנה יותר, סוף המצורף ככל האפשר על מנת לסובב את הלולאה גדול המקורי.
14. חתוך חוט עודף, לכופף את החוט וסובב בחזרה.
15. אם יש דימום יתר, ניתן לעצור אותו עם מקלות כסף חנקתי.
16. כבה את העכבר isoflurane ומקום בכלוב בית אחד כדי להתאושש במשך 5-7 ימים לפני hindlimb פריקה. הטבעות זנב להסתבך אם יש יותר מאחת עכבר שוכן יחד.

1. Hindlimb נוהל פריקה

חומרים

• גודל 10-24 X 4 ברגים במכונה, אחד לכל חיה.
• אגוז לנעול ניילון בגודל 10-24, אחד לכל חיה.
• אגף אגוז 10 בגודל 24 X, שניים לכל בעלי החיים.
• גודל Washer ¼ 1 X, שתי לכל בעלי החיים.
• דייג המסתובב עם גודל הצמד וו # 6, 1-11/16 ", ואף אחד לכל חיה.
• מכונת תפירה מתכת סיסה. אחת לכל חיה.
• נייר קליפ קטן עבור וו בצורת האות S, אחד לכל חיה
• פלייר.
• 2 x 2 "גזה.
• 2 "קלסר שחור מהדק נייר.
• סרט דביק קלטת / מעבדה.
• 1-3/8 "בר מצופים פלדה מחוררת המשתרע מעט מעבר באורך מלא של הכלוב
• 50 ס"מ X 40 ס"מ X 20 ס"מ כלוב (כלוב חולדה).
• בקבוק מים עם צינור bended.
• נירוסטה תיל פלדה, בצורת U לתמוך בקבוק מים.

קייג' ההתקנה

1. הנח את "1-38 פלדה מצופים בר מחוררת מעל הכלוב, ואת קלטת אותה temporally למטה עם סרט דביק.
2. בורג 1 אגוז כנף לדפוק את המכשיר, להוסיף מכונת כביסה, והכנס את השוקת בורג במכונה פלדה מחוררת ± 15 ס"מ מהקצה של הכלוב.
3. הוסף מכונת כביסה אגוז כנף. הדקו הן אגוזים כנף, אך לא להדק באופן מלא, שכן יהיה צורך לעשות התאמות מאוחר יותר.
4. הכנס את בורג במכונה דרך החור במרכז של סיסה.
5. כדי למנוע את הסליל מליפול, לדפוק את אגוז לנעול ניילון לסוף בורג במכונה. סיסה אמור להסתובב בחופשיות.
6. הכנס את הצמד וו מן המסתובב הדיג דרך החלק התחתון של סיסה.
7. השתמש צבת להקים וו בצורת האות S מ מהדק. (גזור מן 2cm קליפ נייר בצורת וו).
8. הכנס קצה אחד של וו בצורת האות S דרך החור של המסתובב הדיג ולצבוט אותו בחוזקה עם צבת.
9. מניחים את החוט בצורת U, במקביל בורג במכונה, על החלק הפנימי של הצד כלוב, לכופף את הקצוות חזרה לתמוך בקבוק מים מלא.
10. הכנס את בקבוק מים לתוך חוט בצורת U, עם spicket פונה כלפי מטה, אבל לא נוגע בתחתית.
11. בנד 2 "קלסר מהדק פתוחים, כך שהם לא יכולים לסגור קרוב. פשוט מתח מספיק כדי להחזיק 3-4 חתיכות של מזון זה בלי זה נושר. זה מונע את הכוח של מהדק מן ריסוק המזון, או שתסגור על האף העכבר.
12. מקום 3-4 חתיכות של מכרסם האוכל לתוך מהדק את הקלסר.

Hindlimb פריקה של עכבר

1. הכנס את הקצה הפתוח של וו בצורת האות S דרך טבעת קטנה יותר של טבעת הזנב.
2. התאם את גובה העכבר על ידי הידוק או התרופפות אגוז כנף נמוכה על בורג במכונה. הגפיים התחתונות לא צריך להיות נשיאת משקל. לאחר גובה אופטימלי מושגת להדק את האום האגף העליון.
3. מיקום מחדש של בקבוק מים, בצורת חוט, כך העכבר לא יכול לטפס על spicket עם hindlimbs שלה. אבטח את בקבוק המים בנייר דבק בצד הכלוב.
4. מקמו את מהדק קלסר עם אוכל על תחתית הכלוב, כך העכבר לא יכול לטפס על זה, קלטת אותו עם סרט דביק.
5. חזור על אותו הליך, אם אחד או יותר של בעלי חיים היא פרקו hindlimb בצד השני של הכלוב. בית שתי חיות לכל כלוב; בחלל בעלי חיים, כך שהם יכולים כמעט לגעת זה בזה.
6. השתמש 2 X 2 גזה כדי רופף לעטוף את הזנב של העכבר על המסתובב הדגים. השתמש פיסה קטנה של סרט כדי לעטוף התחבושת, הבטחת גזה את הזנב. שלב זה חשוב כדי למנוע את הזנב שמוט כלפי מטה, המוביל דם נקווה קצה הזנב כי הזנב הופך נמקי.
7. הוספת כמות קטנה של מצע קלח לכלוב. אל תוסיף יותר מדי מצעים אחרת העכבר יהיה מן תלולית של מצעים ניסיון לטעון hindlimbs על מצע.

2. נציג תוצאות:

כדי להקים את ההצלחה של הטכניקה HU זנב טבעת מדדנו משקל גוף החיה לפני הניתוח טבעת הזנב, ולפני ואחרי HU והתאוששות; מסה soleus שריר, ומסת הכליה בכל הקבוצות.

משקולות גוף של עכברים במשך הניסוי מוצגות באיור 1. משקולות גוף של עכברים לפני הניתוח זנב טבעת (24.7 ± 3.5G) לא היו שונים משמעותית אחרי 5 ימים של התאוששות מהניתוח זנב טבעת (24.3 ± 2.9g) לקראת האוניברסיטה. גם לא ירידה משמעותית במשקל הגוף מיד לאחר 14 ימים של האוניברסיטה העברית (22.7 ± 1.9g), 28 ימים של האוניברסיטה העברית (21.3 + 2.1g) או לאחר 3 ימי התאוששות מן האוניברסיטה העברית (24.0 ± 1.8g). למרות האוניברסיטה העברית עבור 14 ו 28 ימים הביא להפסד קטן (-6.8% ו 12%) אך לא משמעותי המוני הגוף, העכברים התאושש באופן מלא מראש HU שלהם משקולות הגוף אחרי 3 ימים של התאוששות. צריכת מזון עכברים שליטה אמבולטורי ועכברים האוניברסיטה העברית מוצגת באיור 3. מזון ממוצע הצריכה היומית לא היה שונה בעכברים HU על 28 ימים בהשוואה לקבוצת הביקורת.

צפינו ניוון שרירים משמעותי soleus הבאים האוניברסיטה העברית במשך 14 ו - 28 ימים (-39.1% ו -46.6%) המציין הליך יעיל HU (איור 2). יתר על כן זו דרגת ניוון עולה בקנה אחד עם הערכים בספרות הצפוי 2-4 שבועות של האוניברסיטה העברית ^{2, 7, 8.} לאחר 3 ימים של התאוששות מן האוניברסיטה העברית soleus מסה משמעותית ל -74% של ערכים שליטה. מסה Soleus בקבוצה התאוששות משמעותית יותר מאשר בשתי הקבוצות האוניברסיטה העברית, אבל עדיין משמעותית פחות חיות בקרת אמבולטורי.

משקולות הכליה נמדדו אינדיקטור ללחץ בעלי חיים, הן את בלוטת יותרת הכליה מימין ומשמאל היו נכרת ומשקלו. משקולות הממוצע היה דומה לבקרה HU עכברים עכברים בכל הקבוצות (איור 4).

בעבר היינו אצל חולדות הראו כי שיעור ההצלחה עבור מספר בעלי חיים בתחילת HU לעומת מספר החיות השלימה HU בלי יוצא של מנגנון ההשעיה (עקב חיות לעיסה באמצעות קלטת זנב המתיחה) היה 10 מתוך של 12 בטכניקה מורי ^{הולטון-1.} אף אחד העכברים (n = 54) במחקר זה מעולם לא ירדה מן ההשעיה לפני השלמת תקופת האוניברסיטה העברית. עשינו זאת, יש עכבר אחד שהתפתח זנב מודלק קשות. כאשר דלקת התברר, הסרנו את הטבעת הזנב כדי לאפשר את האזור מודלק לרפא, ולאחר מכן להציב עוד זנב טבעת כדי להשלים את משך הזמן של האוניברסיטה העברית.

בעבר, כאשר השתמשנו בשיטת מורי-הולטון של האוניברסיטה העברית, אנו בדרך כלל לחסל 1-2 עכברים / קבוצה, כי הם באים מתוך מנגנון ההשעיה. בשיטה שובל, הטבעת לא היו פרקים של עכברים בשוגג יוצא של המנגנון האוניברסיטה העברית בתקופת האוניברסיטה העברית במשך 14 או 28 ימים (n = 54 עכברים).

באיור 1. משקל גוף שינויים (ממוצע ± SD). קיצורים: CON: נושאת משקל העכברים הביקורת (n = 76); Pre-HU: כל העכברים לפני האוניברסיטה (n = 54); HU14: hindlimb עכברים פרקו למשך 14 יום (n = 34); HU28: hindlimb עכברים פרקו עבור 28 ימים (n = 20); REC: עכברים hindlimb פרקו מותר כלוב להתאושש במשך 3 ימים (n = 22). הבדלים משמעותיים במשקל הגוף נצפו בין הקבוצות.

2. ניוון שרירים איור Soleus (ממוצע ± SD). קיצורים: CON: נושאת משקל העכברים הביקורת (n = 76); HU14: hindlimb עכברים פרקו למשך 14 יום (n = 34); HU28: hindlimb עכברים פרקו במשך 28 ימים (n = 20); ו REC: עכברים hindlimb פרקו מותר לכלוב להתאושש במשך 3 ימים (n = 22). * שונה באופן משמעותי (p <0.001) מאשר השליטה נושאת משקל (CON). שונה δSignificantly (p <0.01) מאשר שתי הקבוצות האוניברסיטה העברית.

467fig3.jpg "alt =" איור 3 "/>
איור 3. צריכת מזון (ממוצע ± סטיית תקן). ממוצע צריכת המזון היומית (גרם / יום) במהלך נושאות משקל ו hindlimb פריקה. קיצורים: נושאת משקל העכברים הביקורת (n = 76), האוניברסיטה העברית: עכברים hindlimb unloaded14 - 28 ימים. אין הבדלים משמעותיים בין CON וקבוצות HU נצפו.

איור 4. המוניים הכליה (ממוצע ± SD). קיצורים: CON: נושאת משקל העכברים הביקורת (n = 76); HU14: hindlimb עכברים פרקו למשך 14 יום (n = 34); HU28: hindlimb עכברים פרקו במשך 28 ימים (n = 20); ו REC: עכברים hindlimb פרקו מותר לכלוב להתאושש במשך 3 ימים (n = 22). הבדלים משמעותיים נצפו בין הקבוצות.

הערכנו שיטה חלופית של עכברים hindlimb פריקה, אשר אנו נחושים להיות מוצלח ביותר. השיטה זנב טבעת כמתואר כאן שימש ההשעיה לטווח ארוך hindlimb, וכדי ללמוד HU התאוששות הבאים. תחת כל התנאים הללו, לא היתה שום ראיה לכישלון להסתגל כפי שמעידים צריכת מזון יציבה, משקולות הגוף, משקולות הכליה של העכברים. זו טכניקה זנב טבעת HU קל לביצוע והוא יכול בקלות להיות משולב עם תרגול כירורגי מעט מאוד.

ישנם מספר יתרונות השיטה זנב טבעת לעומת השיטה המסורתית ⁶ מורי ^{הולטון-5,.} ראשית, את העור ואת ההשתלה אתר טבעת על הזנב, כי הם תמיד נראים לעין, כך שאם מתעוררות בעיות ברור מיד, ולא רק בסוף תקופת ההשעיה. שנית, בעלי חיים אינם מסוגלים לצאת מנגנון ההשעיה בכל עת במהלך האוניברסיטה העברית, obviating את הצורך להכריע האם להמשיך עכבר או לא ערכת הנתונים. יתר על כן, העכברים לא טורחים מנגנון הטבעת כאשר הם משתחררים מן האוניברסיטה העברית להתאוששות, הם לא להתעסק עם הזנבות שלהם, המאפשר לשלב ההתאוששות חלקה הבא של האוניברסיטה העברית. לבסוף, עכברים פרקו hindlimb עם שיטת זנב טבעת לשמור על משקל גוף שלהם טוב יותר מאשר עכברים hindlimb פרקו בטכניקת זנב המתיחה מורי-הולטון. בידיים שלנו לאחר 14 ימים של האוניברסיטה העברית צפינו הפסד קטן (-6.8%) אך לא משמעותי המוני הגוף. בעוד אינגלס et al. נצפתה ירידה משמעותית -12% ממשקל הגוף אצל עכברים לאחר 14 ימים של האוניברסיטה העברית על ידי מורי שיטת-הולטון ^3. למרות אינגלס לא דיווחו משקולות יותרת הכליה, נראה כי שיטת זנב טבעת שלנו מעניק פחות לחץ על העכבר (משקולות הכליה בעכברים HU שלנו אינם שונים מאשר שולטת) ותחזוקה טובה יותר של משקל הגוף לאורך כל התקופה hindlimb פריקה.

לסיכום, טבעת זנב שיטת hindlimb הפריקה היה שפותחו ונבדקו על עכברים האוניברסיטה העברית עבור 14 ו 28 ימים, על עכברים חזר התאוששות בכלוב במשך 3 ימים אחרי האוניברסיטה העברית. על בסיס משקולות הכליה, מסת הגוף ואת צריכת המזון, עכברים הנראה מותאם היטב מנגנון זנב הטבעת. Hindlimb זנב טבעת פריקה השיטה היא אלטרנטיבה יעילה, פשוטה את הטכניקה המסורתית מורי-הולטון פריקה hindlimb.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המחברים מבקשים להודות אנדרו J דאן, תלמידה מצטיינת לתואר מחקר במעבדה שלנו, לקבלת סיוע טכני שלו ודואג לבעלי החיים. מכון הבריאות הלאומי מענק HD058834 של אוניברסיטת מיזורי מדעי החיים המלגה במימון העבודה הזאת.

1. Brown M, Foley AM, Hasser EM, and Foley CM. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol 12: 43-50, 2005.
2. Fitts RH, Metzger JM, Riley DA, and Unsworth BR. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol 60: 1946-1953, 1986.
3. Ingalls CP, Warren GL, and Armstrong RB. Intracellular Ca²⁺ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology 87: 386-390, 1999.
4. Morey E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience 29: 168-172, 1979.
5. Morey-Holton ER, and Globus RK. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone 22: 83S-88S, 1998.
6. Morey-Holton ER, and Globus RK. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol 92: 1367-1377, 2002.
7. Thomason DB, and Booth FW. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol 68: 1-12, 1990.
8. Thomason DB, Herrick RE, Surdyka D, and Baldwin KM. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol 63: 130-137, 1987.

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.