Um Método para o alternante dos membros posteriores NASA modelo tradicional de Descarga em Ratos

Ferreira, J. A., Crissey, J. M., Brown, M. An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice. J. Vis. Exp. (49), e2467, doi:10.3791/2467 (2011).

O Morey-Holton hindlimb descarga método (HU) é um amplamente aceito National Aeronautics and Space Administration (NASA) baseados em terra modelo para estudar desuso atrofia-nos roedores ^4-6. Nosso estudo avaliou um método alternant ao Morey-Holton HU padrão-ouro técnica de tail-tração em camundongos. Cinqüenta e quatro camundongos fêmeas (4-8 mo.) Foram HU por 14 dias (n = 34) ou 28 dias (n = 20). Recuperação do HU foi avaliada após três dias de deambulação gaiola normal após HU (n = 22). Camundongos com idade casadas (n = 76) serviu de suporte de peso controles.

Antes de HU um anel da cauda foi formada com um fio de aço 2-0 cirúrgica estéril que foi passado através do 5 ^º, 6 ^º ou 7 ^º espaço inter-vertebral em forma de disco e em um anel a partir do qual os ratos foram suspensos. Localização vertebral para a cauda anel foi selecionado para equilibrar o peso corporal em animais, sem interferir com a defecação.

Determinou-se o sucesso desta técnica HU romance de avaliar o peso corporal antes e depois HU, grau de atrofia sóleo, e HU massa adrenal seguinte. Peso corporal dos camundongos antes HU (24,3 ± 2.9g) não alterou significativamente o declínio imediatamente após 14d de HU (22,7 ± 1,9 g), 28d do HU (21,3 + 2.1g) ou após a recuperação de 3 dias (24,0 ± 1,8 g) . Sóleo massa muscular diminuiu significativamente (-39,1% e -46,6%), seguindo HU por 14 dias e 28 dias, respectivamente (p <0,001). Após três dias de recuperação da massa sóleo aumentou significativamente para 74% dos valores controle. Pesos adrenal de ratos HU não foram diferentes em comparação a camundongos controle.

O sucesso do nosso método HU romance é evidenciada pela manutenção do peso do animal corpo, comparáveis ​​pesos glândula adrenal, e atrofia sóleo seguintes HU, correspondentes aos valores esperados literatura ^{2, 7, 8.} As principais vantagens deste método HU incluem: 1) facilidade de análise da cauda durante a suspensão, 2) diminuição da probabilidade de caudas cianótica, inflamada, e / ou necrose freqüentemente observados com a cauda de gravação e HU; 3) há possibilidade de camundongos mastigar a tração fita e saindo do aparelho de suspensão; e 4) recuperação rápida e atividade normais imediatamente após a gaiola HU.

Cirurgia pré-Instrumentos / Materiais

• Cortadores de fio / alicates
• Gaze 2 x 2 "pads
• Almofada de aquecimento
• Prata nitrato de varas
• Luvas cirúrgicas estéreis
• Isoflurano inalatório
• Gluconato de clorexidina 4% (matagal cirúrgica anti-séptico)
• Estéril 2-0 sutura aço cirúrgico
• 25 X 5 / 8 agulha Um medidor (autoclavado)
• Hemostat (autoclavado)
• Sutura aço cirúrgico

Procedimento Cirúrgico

1. Criar um campo estéril. Seguir o procedimento estéril.
2. Anestesiar mouse com 2-3% de isoflurano.
3. Lugar do mouse sobre a almofada de aquecimento.
4. Scrub cauda com solução de clorexidina.
5. Localize 5, 6 ou 7 ^º espaço intervertebral (entre duas protuberâncias ósseas na cauda, ​​começam a contar a partir do final de pêlos no corpo, na base da cauda).
6. Use hemostat e agulha 25G para fazer um furo piloto entre duas vértebras, para o espaço intervertebral.
7. Use o alicate para cortar o fio de aço 10 cm de comprimento.
8. Remova a agulha de sutura de aço e inserir através do orifício, 5 cm de sutura em cada extremidade da cauda.
9. Cada lado da cauda deve ter + 5 cm de sutura.
10. Mergulhe a ponta do polegar até a cauda.
11. Use sua mão livre e vento a sutura de aço na ponta de seu polegar e torça as pontas para formar um laço grande. A parte ferida ou circular deve ser + 3 mm de comprimento.
12. Retire o seu polegar.
13. Pinça um fio de sutura com o hemostat e dobrá-la em um pequeno laço, a fim de que está ligado o mais próximo possível ao torção no loop original de grande porte.
14. Cortar fios em excesso, e dobrar o fio torcido para trás.
15. Se houver qualquer sangramento em excesso, pode pará-lo com as varas de nitrato de prata.
16. Desligue o mouse isoflurano e coloque em uma gaiola única casa para se recuperar de 5-7 dias antes do membro posterior descarga. Os anéis da cauda entalada se mais de um mouse é alojados juntos.

1. Membro posterior procedimento de descarregamento

Materiais

• Tamanho 24/10 X 4 parafusos, um por animal.
• Nylon tamanho porca 10-24, uma por animal.
• Asa castanha tamanho 10 X 24, dois por animal.
• Tamanho da anilha ¼ X 1, duas por animal.
• Giratória de pesca com tamanho Gancho # 6, 1-11/16 ", e um animal por.
• Máquina de costura de metal da bobina. Um animal por.
• Clipe de papel pequeno para S-shaped gancho, um por animal
• Alicates.
• 2 x 2 gaze ".
• 2 "braçadeiras aglutinante de papel preto.
• Fita tape / laboratório duto.
• 1-3/8 "bar em aço galvanizado com fenda que se estende um pouco além do comprimento total da gaiola
• 50cm x 40cm x 20cm gaiola (gaiola de rato).
• Garrafa de água com tubo dobrado.
• Fio de aço inoxidável, em forma de U para apoiar garrafa de água.

Setup gaiola

1. Estabelecer as 1-38 "bar em aço galvanizado com fenda por cima da gaiola, e fita-lo temporariamente para baixo com fita adesiva.
2. Parafuso 1 porca borboleta para o parafuso de máquina, inserir uma máquina de lavar, e insira o parafuso de máquina através da chapa de aço encaixados ± 15 cm da borda da gaiola.
3. Adicionar outra arruela e porca de asa. Aperte as porcas tanto asa, mas não aperte, pois será necessário fazer ajustes posteriores.
4. Insira o parafuso de máquina através do orifício centro da bobina.
5. Para evitar que a bobina de cair, o parafuso porca de nylon para o final do parafuso da máquina. A bobina deve girar livremente.
6. Insira o gancho do giro de pesca através da parte inferior da bobina.
7. Use um alicate para formar um gancho em forma de S a partir do clipe. (Corte dois centímetros do clipe de papel para formar um gancho).
8. Insira uma ponta do anzol em forma de S através do orifício da peça giratória de pesca e pinch-la fechada com o alicate.
9. Coloque o fio em forma de U, em paralelo com o parafuso, no interior do lado da gaiola, e dobre as pontas para trás para suportar uma garrafa de água cheia.
10. Inserir a garrafa de água no fio em forma de U, com o spicket virada para baixo, mas não tocando o fundo.
11. Dobre os dois "binder clamp aberto, de modo que não pode fechar perto. Apenas a tensão suficiente para manter 3-4 pedaços de comida na mesma sem ele cair. Esta é impedir a força da pinça de esmagamento do alimento, ou reprimir o nariz mouse.
12. Coloque 3-4 pedaços de para roedores no grampo ligante.

Membro posterior descarga de Mouse

1. Inserir a extremidade aberta do gancho em forma de S através do anel menor do anel da cauda.
2. Ajuste a altura do mouse, apertar ou afrouxar a porca inferior da asa no parafuso da máquina. As extremidades inferiores não deve ser rolamento do peso. Uma vez que a altura ideal é alcançada aperte a porca de asa superior.
3. Reposicionar a garrafa de água, e em forma de U de fio para que o mouse não pode subir no spicket com seus membros posteriores. Segura a garrafa de água com fita adesiva para o lado da gaiola.
4. Posição do grampo fichário com comida no fundo da gaiola para que o mouse não pode subir nela; tape-a com fita adesiva.
5. Repita o mesmo procedimento se mais de um animal é descarregado hindlimb do outro lado da gaiola. Casa de dois animais por gaiola, espaço os animais para que eles possam quase se tocam.
6. Use a 2 X 2 gaze para enrole frouxamente a cauda do mouse sobre o giro de peixe. Use um pequeno pedaço de fita para envolver a gaze, garantir a gaze para a cauda. Este passo é importante para evitar a cauda de drooping para baixo, levando ao acúmulo de sangue na ponta da cauda e que a cauda se tornar necrótico.
7. Adicionar uma pequena quantidade de cama cob para a jaula. Não adicione cama muito caso contrário o mouse de um monte de roupa de cama e tentar carregar hindlimbs na cama.

2. Resultados representativos:

Para estabelecer o sucesso da técnica HU cauda anel medimos massa corporal do animal antes da cirurgia anel cauda, ​​e antes e depois HU e recuperação; sóleo massa muscular e massa adrenal em todos os grupos.

Peso corporal dos camundongos durante o experimento são mostrados na Figura 1. Peso corporal dos camundongos antes da cirurgia anel da cauda (24,7 ± 3,5 g) não foram significativamente diferentes após 5 dias de recuperação da cirurgia do anel da cauda (24,3 ± 2.9g) antes do HU. Nem o peso corporal significativamente declínio imediatamente após 14 dias de HU (22,7 ± 1,9 g), 28 dias de HU (21,3 + 2.1g) ou depois de 3 dias a partir da recuperação HU (24,0 ± 1,8 g). Embora HU para 14 e 28 dias, resultou em uma pequena perda (-6,8% e 12%), mas não significativo na massa corporal, os ratos totalmente recuperado de sua pré-HU peso corporal após 3 dias de recuperação. Consumo de alimento para ratos e camundongos controle ambulatorial HU é mostrado na Figura 3. Ingestão média diária de alimento não foi diferente em camundongos HU mais de 28 dias em comparação aos controles.

Observou-se atrofia muscular significativa sóleo seguintes HU para 14 e 28 dias (-39,1% e -46,6%), indicando um procedimento eficaz HU (Figura 2). Além disso, este grau de atrofia é consistente com os valores esperados para a literatura 2-4 semanas de HU ^{2, 7, 8.} Após três dias de recuperação da HU sóleo massa aumentou significativamente para 74% dos valores controle. Sóleo em massa no grupo de recuperação foi significativamente maior que os grupos de ambos os HU, mas ainda assim significativamente menos do que animais do grupo controle ambulatorial.

Adrenal pesos foram medidos como um indicador do estresse animal; ambas as glândulas supra-renais esquerda e direita foram excisados ​​e pesados. Os pesos médios foram comparáveis ​​para o controle de ratos e camundongos HU em todos os grupos (Figura 4).

Anteriormente em ratos que mostraram que a taxa de sucesso para o número de animais no início do HU em relação ao número de animais que completou HU sem sair do aparelho de suspensão (devido à mastigação animais através da fita cauda-tração) foi de 10 out de 12 usando a técnica de Morey-Holton ^1. Nenhum dos ratos (n = 54) neste estudo já desceu da suspensão antes do término do período HU. Fizemos no entanto, têm um rato que que desenvolveu uma cauda muito inflamada. Quando a inflamação se tornou evidente, nós removemos o anel da cauda para permitir que a área inflamada para curar, e posteriormente colocadas uma outra cauda anel para completar a duração do HU.

No passado, quando nós usamos o método Morey-Holton do HU, que normalmente 1-2 eliminar ratos / grupo, porque eles saem do aparelho de suspensão. Com o método de fuga de anel não houve episódios de ratos, inadvertidamente, que sai do aparelho HU durante o período de HU para 14 ou 28 dias (n = 54 ratos).

Figura 1. Corporal Alterações Peso (média ± DP). Abreviaturas: CON: ratos peso-rolamento controle (n = 76); Pré-HU: todos os camundongos antes de HU (n = 54); HU14: hindlimb ratos descarregado por 14 dias (n = 34); HU28: hindlimb ratos descarregado para 28 dias (n = 20); REC: ratos hindlimb descarregado permitido recuperar gaiola por 3 dias (n = 22). Não houve diferenças significativas no peso corporal foram observadas entre os grupos.

Figura 2. Atrofia músculo sóleo (média ± DP). Abreviaturas: CON: ratos peso-rolamento controle (n = 76); HU14: hindlimb ratos descarregado por 14 dias (n = 34); HU28: hindlimb ratos descarregado por 28 dias (n = 20) e REC: ratos hindlimb descarregado permitido a gaiola recuperar durante 3 dias (n = 22). * Significativamente diferente (p <0,001) do peso-rolamento de controle (CON). δSignificantly diferentes (p <0,01) do que ambos os grupos HU.

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Figura 3 Consumo Alimentar. (Média ± DP). Ingestão de alimentos médio diário (g / dia) durante peso-rolamento e descarga hindlimb. Abreviaturas: ratos peso-rolamento controle (n = 76); HU: ratos hindlimb unloaded14 - 28 dias. Não houve diferenças significativas entre os grupos CON e HU foram observados.

Figura 4. Massa Adrenal (média ± DP). Abreviaturas: CON: ratos peso-rolamento controle (n = 76); HU14: hindlimb ratos descarregado por 14 dias (n = 34); HU28: hindlimb ratos descarregado por 28 dias (n = 20) e REC: ratos hindlimb descarregado permitido a gaiola recuperar durante 3 dias (n = 22). Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos.

Nós avaliamos um método alternativo de ratos hindlimb descarga, o que estamos determinados a ser um grande sucesso. O método de cauda-anel, conforme descrito aqui foi usada a longo prazo de suspensão dos membros posteriores, e estudar HU recuperação a seguir. Em cada uma dessas condições, não havia nenhuma evidência de falta de adaptação como evidenciado pela ingestão de alimentos estável, peso corporal e pesos adrenal de camundongos. Esta cauda anel técnica HU é de fácil execução e pode ser facilmente incorporado com muito pouco prática cirúrgica.

Existem várias vantagens da cauda anel método em comparação com o tradicional Morey-Holton ^{5, 6} método. Primeiro, a pele eo local de implantação do anel em que a cauda sempre são visíveis, por isso, se surgirem problemas, é evidente de imediato, não apenas no final do período de suspensão. Em segundo lugar, os animais não são capazes de sair do aparelho de suspensão a qualquer momento durante HU, eliminando a necessidade de fazer uma determinação de se manter o rato ou não no conjunto de dados. Além disso, os ratos não incomodar o aparelho tocar e quando eles são liberados da HU para a recuperação, eles não interfira com as suas caudas, permitindo uma fase de recuperação contínua seguintes HU. Finalmente, hindlimb ratos descarregado com o método de cauda anel manter seu peso corporal melhor do que os ratos hindlimb descarregado pelo Morey-Holton técnica de tail-tração. Em nossas mãos após 14 dias de HU observou-se uma pequena perda (-6,8%), mas não significativo na massa corporal. Considerando Ingalls et al. Observada uma diminuição significativa -12% do peso corporal em ratos após 14 dias de HU pelo método de Morey-Holton ^3. Embora Ingalls não relataram pesos adrenal, parece que o nosso método cauda anel confere menos stress sobre o mouse (pesos adrenal em ratos nosso HU não são diferentes do que os controles) e melhor manutenção do peso corporal ao longo do período hindlimb descarga.

Em resumo, um método do anel da cauda de hindlimb descarga foi desenvolvido e testado em camundongos HU para 14 e 28 dias, e em ratos voltaram para a recuperação da gaiola por 3 dias após HU. Com base em pesos adrenal, massa corporal e ingestão de alimentos, os camundongos parecem ter se adaptado bem ao aparelho cauda-anel. A cauda hindlimb anel descarga método é uma alternativa útil, simples para o Morey-Holton hindlimb tradicional técnica de descarga.

Não há conflitos de interesse declarados.

Os autores gostariam de agradecer a Andrew J Dunn, um estudante excelente pesquisa de graduação em nosso laboratório, por sua assistência técnica e cuidar dos animais. O Instituto Nacional de Saúde conceder HD058834 e da Universidade de Missouri Life Sciences Fellowship financiado este trabalho.

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