זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

Parvin, J., Chiba, N., Ransburgh, D. Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1. J. Vis. Exp. (48), e2468, doi:10.3791/2468 (2011).

ניתוח פונקציונלי של מוטציות missense יכול להיות מסובך ידי נוכחות בתא של חלבון אנדוגני. מבנה פונקציה ניתוח BRCA1 כבר מסובך מחוסר assay חזקים החלבון BRCA1 מלא אורך הקשיים הכרוכים בעבודה עם שורות תאים המבטאים חלבון BRCA1 hypomorphic ^1,2,3,4,5. פיתחנו מערכת לפיה את החלבון BRCA1 אנדוגני בתא היה מדולדל בחריפות על ידי RNAi מיקוד 3'-UTR-mRNA BRCA1 ו הוחלף על ידי שיתוף transfecting פלסמיד המבטא גרסה BRCA1. אחד היתרונות של הליך זה היא כי ההשתקה חריפה של החלפת BRCA1 ו סימולטני לאפשר לתאים לגדול ללא מוטציות משני או התאמות שעלולות להתעורר לאורך זמן על מנת לפצות על אובדן של הפונקציה BRCA1. דלדול זה ולהוסיף גב ההליך נעשה קו הלה הנגזרות תא היה assayed בקלות לפעילות הומולוגיים רקומבינציה. Assay הומולוגיים רקומבינציה מבוסס על שיטה שפורסמו בעבר לפיה מצע רקומבינציה משולב לתוך הגנום (איור 1) ^6,7,8,9. זה המצע רקומבינציה יש נדיר חיתוך I-SCEI אנזים הגבלה בתוך אתר אלל GFP פעיל, במורד הוא אלל second-GFP פעיל. Transfection של פלסמיד המבטא I-SCEI תוצאות לשבור פעמיים תקועים, אשר עשוי להיות מתוקן על ידי רקומבינציה הומולוגיים, ואם הומולוגיים רקומבינציה עושה לתקן את לשבור אותו יוצר אלל GFP פעיל כי הוא הבקיע בקלות ביטוי חלבון ה-GFP על ידי זרימת cytometry . דלדול של BRCA1 אנדוגני הביא לירידה של 8-10 פי בפעילות הומולוגיים רקומבינציה, ולהוסיף גב של הפונקציה רקומבינציה פלסמיד wild-type שוחזר במלואו הומולוגיים. כאשר נקודה מסוימת של מוטציות BRCA1 באורך מלא באו לידי ביטוי מתוך שיתוף transfected פלסמידים, ההשפעה של מוטציה missense ספציפי יכול להיות קלע. כדוגמה, את הביטוי של החלבון BRCA1 (M18T), סוג של משמעות קלינית ידוע ^10, באה לידי ביטוי התאים האלה, היא לא הצליחה לשחזר BRCA1 תלויי הומולוגיים רקומבינציה. על ידי הביטוי לעומת זאת, גרסה של אחר, גם משמעות ידועה, BRCA1 (I21V) שוחזר במלואו BRCA1 תלויי הומולוגיים פונקציה רקומבינציה. אסטרטגיה זו של בדיקות תפקוד של מוטציות BRCA1 missense הוחל על מערכת ביולוגית אחרת assaying לתפקוד centrosome (קייס ואח', תצפיות לא פורסם). ככלל, גישה זו מתאימה לניתוח מוטציות בגן missense כל זה יש לנתח recessively.

1. Cell קו עם המצע רקומבינציה משולב

1. התאים הלה הפכו ביציבות עם PDR-GFP (מתנה פלסמיד ⁷ מ מ Jasin, ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center) ומתוחזק puromycin לבחירת transformants.
2. התאים passaged ב DMEM / FBS, המכיל 10% בסרום שור עוברית, 2 מ"מ GlutaMAX, נתרן 1 mM pyruvate, פניצילין / סטרפטומיצין (100 U / mL/0.1 מ"ג / מ"ל), ו 1.5 UG / mL puromycin.

המצע רקומבינציה ב-GFP-PDR הפלסמיד, וב transformants יציבה, מכיל שני אללים פעיל של ה-GFP (איור 1). אחת אלל אינו פעיל עקב הכללת ברצף קידוד של האתר 18 נ"ב אנזים הכרה הגבלה עבור I-SCEI. הביטוי של I-SCEI בתאים אלה יוצר לשבור פעמיים גדילי דנ"א (DSB). יש האלל השני של ה-GFP פעיל על ה-DNA הזה, אבל את החלק של הרצף שלה בקורלציה עם האתר I-SCEI על האלל הראשון הוא wild-type. זה האלל GFP השני יכול לתפקד בתור התורם רצף לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של DSB ו תביא אלל GFP פעיל, אשר מזוהה בקלות על ידי cytometry הזרימה. לחלופין, DSB יכול להיות מתוקן על ידי nonhomologous סוף להצטרף, אשר יהרוס את האתר I-SCEI הגבלה תגרום GFP שלילי תאים. רמת רקומבינציה הומולוגיים בתא נקבע על ידי ספירת אחוז GFP חיובי תאים.

קו זה התא, pHeLa-DR13-9, נבחר בין כל הכפילים לאות אפס רקע GFP ואחוז גבוה יחסית של ה-GFP חיובית על תאים transfection עם I-SCEI להביע pCBASce פלסמיד,. (PCBASce ושליטה וקטור שלה, pCAGGS, היו שניהם מסופק על ידי מ 'Jasin של מרכז הסרטן סלואן קטרינג הזיכרון).
השורה הלה-DR13-9 תאים זמין המחברים על פי בקשה.

2. Transfection כדי לכלות BRCA1 אנדוגני הוסף חזור BRCA1 Mutant.

1. יום לפני transfection הראשונה (בדרך כלל יום שלישי): התחל עם צלחת 10 ס"מ של הלה-DR13-9 תאים לפחות 90% ומחוברות.
2. Trypsinize ב 1 מ"ל ולעצור את התגובה על ידי הוספת 9 מ"ל DMEM / FBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting.
3. הוסף 40 μL של תאים trypsinized היטב לכל צלחת 24 היטב מ"ל של 0.5 DME / FBS.
4. 1 יום transfections (יום רביעי): תאים יש ~ ומחוברות 40-50%, אם הרבה פחות ולהתחיל מחדש. Transfect על ידי ערבוב: 5 siRNA pmol + 0.3 UG BRCA1-DNA פלסמיד המבטא מוטציה ב 12.5 μL Opti-ממ, ו 0.5 Lipofectamine μL 2000 ב 12.5 μL Opti-ממ. המשך transfection על פי פרוטוקול Lipofectamine (Invitrogen).
5. החלף את המדיה 4-6 שעות מאוחר יותר. SiRNA אנו משתמשים כדי לרוקן BRCA1 מבוסס על GCUCCUCUCACUCUUCAGU רצף ציון BRCA1 3'-UTR רצפים 80,780 עד 80,798 (מספר ההצטרפות AY273801).
6. יום 2: העברת התאים על ידי trypsinizing מהצלחת גם 24 לצלחת 6 באר.
7. 3 יום transfections: 25 siRNA pmol + 0.75 UG BRCA1-DNA פלסמיד המבטא מוטציה + 0.75 pCBASce UG (או שליטה pCAGGS וקטור) ב 62.5 μL Opti-ממ ו 2.5 Lipofectamine μL 2000 ב 62.5 μL Opti-ממ. החלף את המדיה 4-6 שעות מאוחר יותר.

3. ניתוח Transfectants.

1. ביום 6, trypsinize התאים היטב כל עצירה 1 מ"ל DMEM / FBS. ניתוח תאים לביטוי GFP יכול להיעשות על 5 או 7 ימים, אך אנו מוצאים כי ביום 6 עובד הכי טוב.
2. נתח 10,000 תאים לכל היטב על ידי cytometry הזרימה. אנו משתמשים בכלי בקטון דיקינסון FACSCalibur של אוניברסיטת מדינת אוהיו מקיף סרטן משאב מרכז אנליטי cytometry משותף. יחיד, תאים חיים הם מגודרת באמצעות פרמטרים פיזור קדימה בצד. GFP חיובי תאים מזוהים באמצעות גלאי הקרינה GFP (FL1), והתוצאות מוצגות היסטוגרמה (איור 2, למטה).
3. השמאל על התאים ניתן replated לצילום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אם תרצה בכך.

4. נציג תוצאות:

BRCA1 מסדיר את מסלול תיקון של DNA גדילי כפול נשבר על ידי רקומבינציה הומולוגיים ^6,11. תאים אלה אשר עברו תיקון ע"י רקומבינציה הומולוגיים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2, למעלה). דלדול של תוצאות BRCA1 לירידה GFP חיובי זיהה התאים (איור 2, מימין). התפוקה של FACSCalibur היא היסטוגרמה בעוצמה GFP לכל תא על ציר ה-X ואת מספר התאים על ציר Y (איור 2, למטה). בכל קבוצה טיפוסית של תוצאות מניסוי אחד, 15.5% מכלל התאים היו GFP חיובי לאחר I-SCEI ביטוי ושליטה דלדול RNAi (איור 3). לשם השוואה, דלדול של BRCA1 ו - וקטור להוסיף מופחת בחזרה GFP המרה ל 0.7%. תוספות האחורי של BRCA1 wild-type או של רקומבינציה BRCA1 (I21V) הומולוגיים שוחזר במלואו, כפי שזוהו על ידי השגת 15-16% GFP חיובי תאים. תוספות האחורי של (BRCA1 M18T) מוטציה (איור 3, מסלול 5) היתה השפעה דומה לזו של התוספת האחורי של שליטה וקטור. מאז גרסה זו מתבטאת ברמות דומות כמו חלבון אנדוגני ^9, ולכן אנו מפרשים את וריאנט (M18T) BRCA1 הוא לא פונקציונלי רקומבינציה הומולוגיים.

אנחנו בדרך כלל יש 10-20% של התאים להמיר את ה-GFP חיובי לאחר transfecting הביטוי I-SCEI פלסמיד. דלדול של BRCA1 reproducibly מפחית את ההמרה של ה-GFP חיובי תאים על ידי קיפול על 8-10. למרות אחוזי בפועל של ה-GFP חיובי תאים עשויים להשתנות מניסוי לניסוי, יחס חיובי של ה-GFP בתאים בעקבות דלדול BRCA1 דלדול יחסי שליטה בתוך ניסוי עקבי למדי. אנו לנרמל את התוצאות על ידי קביעת שיעור ההמרה מעצורים עד 100% והתוצאות להביע עם depletions BRCA1 ו התוספת הגב באחוזים. בדרך זו, אנו יכולים לשלב מספר רב של ניסויים, ואת וריאציה הניסוי אינה גבוהה.

הוסף האחורי של מוטציות BRCA1 עד כה הניבו תוצאות חזקות: כל גרסה יש BRCA1 או שמלוא הפעילות הומולוגיים רקומבינציה או יש לו כל השפעה. שיקול חשוב בהשגת התוצאות הללו היא כי התנאים transfection שלנו לייצר רמות של החלבון BRCA1 כי כ שווה את הריכוז של חלבון אנדוגני בתאים שלא טופלו. גבוה מדי של overexpression של מוטציה של BRCA1 פגום אפילו עלול לגרום פעילות כלשהי הומולוגיים חיובי רקומבינציה.

הבעיה שאנחנו צריכים להתגבר היה את הרעילות של transfection. דלדול של BRCA1 עצמה יכול להאט צמיחת תאים, ואת היתרה של ה-DNA Lipofectamine-2000 ו - פלסמיד ביחס למספר התאים על צלחת חייב להתקיים ברמה עקבית. דנ"א מדי Lipofectamine הרבה או פלסמיד תפחית מספרים סלולריים, את מספר התאים יהיה מספיק כדי לקבל תוצאות אמינות cytometry הזרימה. יתרת ריאגנטים פלסמיד ו Lipofectamine לעומת מספר של תאים transfected חשוב מאוד לשמור על יכולת הקיום של התאים.

באיור 1. המצע רקומבינציה. האסטרטגיה אשר פותחה על ידי קבוצה של מ Jasin ^7,12 מתואר. PDR-GFP פלסמיד המכיל שני אללים פגומים של ה-GFP, אשר אחד מהם מכיל I-SCEI endonuclease אתר הגבלה. שורת תאים הנגזרים הלה מכיל זה המצע DNA משולב באתר יחיד הגנום ^9, ותיקון פעיל לשבור פעמיים תקועים ה-DNA באתר I-SCEI על ידי הומולוגיים תוצאות רקומבינציה בהמרה של אלל אחד GFP חיובי.

איור 2. גילוי ה-GFP חיובי תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים נבדקו לפי פרוטוקול זה, שליטה מתרוקנים התאים היו פעילים רקומבינציה הומולוגיים, זוהה על ידי אחוז גבוה של תאים עם ביטוי של GFP (משמאל). דלדול של BRCA1 על ידי תוצאות RNAi לירידה חדה במספר של ה-GFP חיובי תאים (מימין).

איור 3. תוצאות של התוספת האחורי של מוטציות BRCA1 missense. תוצאות מניסוי בודד מוצגים היסטוגרמה זו. בהעדר transfected I-SCEI להביע פלסמיד (מסלול 1) אין GFP חיובי תאים זוהה. התוצאות במסלולים 2-6 נלקחו כל מתאי שבו אני מביע-SCEI הפלסמיד היה transfected ביום 3. בתאים שהיו מרוקנים עבור גן רלוונטית (בלוציפראז) ועם וקטור התוספת בחזרה, 15.5% מכלל התאים היו GFP חיובי (מסלול 2). דלדול של BRCA1 ו - וקטור התוספת בחזרה חושף את ההשפעה של אובדן BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים (מסלול 3). ההשפעות של דלדול של BRCA1 ו התוספת האחורי של BRCA1 wild-type (מסלול 4), BRCA1 (M18T) (מסלול 5), BRCA1 (I21V) (מסלול 6) מוצגים. תוצאות אלו מניסוי אחד, יהיה משולב עם לפחות שני ניסויים חוזרים יותר כדי להשיג מידה של רקומבינציה הומולוגיים נתמך על ידי חלבון נתון מוטציה BRCA1.

היתרון של שיטה זו הוא כי אנו יכולים לחקור את הפונקציה של החלבון BRCA1 בוויסות תיקון DNA על ידי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים בעלי wild-type BRCA1 הביע endogenously. אימצנו שתי שיטות הוקמה נפרדים של הלומדים בתהליך הומולוגיים רקומבינציה של ניצול RNAi בתיווך דלדול כדי להשיג את שיטה חדשה לבדיקת גרסאות BRCA1 עבור לתפקד תיקון דנ"א. המפתח להצלחה של שיטה זו היה להקים קו תא transfectable בקלות, כמו הלה, עם המצע רקומבינציה בגנום כך אנו מקבלים רמות גבוהות מאוד של ההמרה GFP. היו לנו מספר הוקרן שיבוטים של טרנספורמציה המקורי כדי להשיג אחד כי לא היה אות לגילוי GFP ברקע, אבל על transfection הביטוי I-SCEI הפלסמיד לו רמה גבוהה מאוד של ההמרה GFP.

באמצעות שיטה זו, אנו נמצאים כעת בחקירת אחרים ספציפיים חומצה אמינית BRCA1 שאריות עבור לתפקד רקומבינציה הומולוגיים. יחד עם תובנות ביולוגיות מעבודה זו, מסקנות אלה יכול להיות מיושם על גנטיקה וסרטן קליניים. אחוז גבוה של מוטציות BRCA1 missense יש משמעות קלינית ידוע מאז ישנם וריאנטים נדירים רבים, ואין מספיק מידע עבור רבים של אלה לקבוע את הקשר סרטן על ידי ניתוח הפרדה גנטית ^3,10,13,14. באמצעות שיטה זו, התוצאות של גרסה מסוימת על התפקוד הביולוגי של BRCA1 בוויסות הומולוגיים רקומבינציה יכול לשמש כדי ליידע את הנשים לבצע אחת הגרסאות הללו בגנום שלהם.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מודים מרכז אוהיו מקיף אוניברסיטת סרטן למתן מימון עבור עבודה זו.

1. Carvalho, M. A. et al. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res 67, 1494-1501 (2007).
2. Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther 3, 509-514 (2004).
3. Couch, F. J. et al. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat 29, 1314-1326 (2008).
4. Tomlinson, G. E. et al. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res 58, 3237-3242 (1998).
5. Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T. & Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 5134-5139 (2001).
6. Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H. & Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell 4, 511-518 (1999).
7. Nakanishi, K. et al. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 1110-1115 (2005).
8. Pierce, A. J. et al. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol 11, S52-59 (2001).
9. Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E. & Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res 70, 988-995 (2010).
10. Easton, D. F. et al. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet 81, 873-883 (2007).
11. Snouwaert, J. N. et al. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene 18, 7900-7907 (1999).
12. Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N. & Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev 15, 3237-3242 (2001).
13. Spearman, A. D. et al. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol 26, 5393-5400 (2008).
14. Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L. & Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat 119, 737-743 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.