Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

1. Het creëren van virtuele Slices van immunohistochemisch Stained Images

1. Open StereoInvestigator. Leg de schoon objectglas houden het monster in de microscoop houder en visualiseren in Stereo Investigator door te klikken op "Acquisition" en daarna "Live Image" (Acquisition → Live Image). Bepaal de niveaus van blootstelling voor elk kanaal, in onze specifieke voorbeeld, Kanaal 2 wordt gebruikt voor DAPI, Kanaal 3 voor GFP, Channel 4 voor RFP, Channel 5 voor Cy5, en Channel 6 voor Cy7. Gebruik de "Video Histogram" venster, dat de intensiteit van de fluorescentie weergegeven, het bepalen van de blootstelling niveau. Geschikte fluorescentie-intensiteiten zijn bereikt indien de intensiteit staarten af ​​aan de rechterkant van de Video Histogram. Blootstelling kan worden gewijzigd in de "Camera-instellingen 'venster. De Video Histogram kan worden gericht met de microscoop nadruk wiel.
2. Voordat u een Virtual Slice, contour van het monster door te klikken op het scherm op een punt afstand van de steekproef, die een referentiepunt zal in het teken, en vervolgens te klikken op rond de omtrek van het monster. Als de contour is voltooid, klik met de rechtermuisknop en selecteer "Close Contour" om de begin-en eindpunt aan te sluiten.
3. Nadat de contour is gesloten, het veroveren van een Virtual Slice voor het monster (→ Overname Acquire Virtual Slice). Wanneer het Virtual Slice venster opties open, selecteer "High Speed ​​Acquire" evenals automatische scherpstelling door het vinkje in het vakje naast "Manual". Sla het bestand op.
4. De virtuele slice prefocus moet worden gekalibreerd door het selecteren (klik met de rechtermuisknop → Toevoegen aan Site Lijst Focus) en handmatig scherpstellen een aantal willekeurige secties, dat wil zeggen, sites, in de Virtuele Slice voorbeeld. Wanneer er meerdere sites zijn gericht, start de Virtual Slice (klik met de rechtermuisknop → Start Virtual Slice met Prefocus). Na de Virtual Slice voor het eerste monster is voltooid, schakelt u naar het volgende kanaal en pas de belichting. Herhaal stap 4 en 5 voor elk kanaal.

2. Computer-assisted tweedimensionale analyse

Kwantificering van de Eilandjes

1. De beelden worden vervolgens verwerkt met behulp van een ImageJ macro met de naam "IHCVS," dat voor het eerst voorbereidt geladen afbeeldingen voor analyse en kwantificeert kenmerken van eilandjes, zoals cellulaire samenstelling (dat wil zeggen elk gebied van bèta-, alfa-en delta-celpopulaties, en eilandje gebied aan de som-waarde). De stapel is opgesplitst in de afzonderlijke kanalen in ImageJ, waar elk kanaal een aparte afbeelding op basis van de immunohistochemische kleuring laat zien. Elk beeld wordt vervolgens automatisch thresholded, waarna een 8-bit zwart-wit beeld, of een masker, van de thresholded beeld wordt geproduceerd. De apart kanaal beelden worden vervolgens opgeteld rekenkundig in een samengestelde masker, en ImageJ de ingebouwde deeltjes analyse is uitgevoerd op de samengestelde afbeelding.
2. ROI worden vervolgens geïdentificeerd met uitsluiting van deeltjes die kleiner zijn dan een enkele beta-cel (<170 micrometer ^2; oppervlakte die wordt berekend met behulp van een diameter van ~ 15 micrometer; Hara et al., 2003.). De resulterende ROI worden geanalyseerd en gekwantificeerd met behulp ImageJ; kwantificering kan bevatten perimeter (een afstand rond een gebied), rondheid (een zekere mate van rondheid, waar het nummer 1.0 toont een perfecte cirkel), Feret de diameter (de langste afstand binnen een gebied) en het centrum coördinaten voor elk geanalyseerd regio, zodat het eilandje distributie kan wiskundig worden geanalyseerd met behulp van verschillende combinaties van deze parameters en uitgezet in een 3D-grafiek, de gegevens van die zal worden gebruikt voor wiskundige modellering. Een virtueel stukje beeld geanalyseerd in 30 seconden. Meerdere beelden kunnen worden geanalyseerd door het inbedden van het beeld verwerking en analyse script in een lus syntax wordt ondersteund door ImageJ macro-taal. De lus opent alle bestanden in een bepaalde map, analyseert de beelden, en uitgangen resultaten in een nieuwe locatie als een Excel-bestand.
3. De geaggregeerde resultaten worden opgeslagen in een Excel spreadsheet, het opslaan van gegevens, zoals oppervlakte, omtrek, circulariteit, Feret de diameter, en eilandje midden voor elk eilandje, samen met bijbehorende nummers geëtiketteerd in de afbeelding.

Computational Analyse en Histogram Setup

1. Mathematica scripts, die zich automatisch zodra het gestart is, worden gebruikt om de verzamelde gegevens te verwerken spreadsheet, een bedrag van honderdduizenden inzendingen. Een van de kritische processen die worden uitgevoerd is een frequentie-analyse, die een histogram gebruikt om de grootte verdeling te onderzoeken en ook om uitschieters in de data vast te stellen constructen. Onder het script, is totaal eilandje oppervlakte gemeten en vergeleken met andere parameters, met name om de tijd punten of de leeftijd van de alvleesklier, en vervolgens dus weergegeven in een grafiek.

3. Drie-dimensionale reconstructie van de tweedimensionale immunohistochemisch Stained Virtual Slice Images

3D reconstructie van Virtual Slices

1. Kopieer het script ("im_jp2_2_tiff") in de directory (dat wil zeggen, map) dat debevat de JP2 afbeeldingen. Voer het script met de Linux-shell door te typen "./im_jp2_2_tiff" in de console en vervolgens op enter te drukken. Het uitvoeren van dit script zal automatisch converteert alle JP2-afbeeldingen in de map in de tiff-bestanden, dat is het formaat dat wordt gebruikt in de bouw en de kwantificering van de drie-dimensionale stapels van de Virtual Slices. (Opmerking:. Type in "chmod + x im_jp2_2_tiff" als het script niet uitgevoerd, waardoor de tekst bestand om te zetten in een script, zodat het goed kan draaien)
2. Wanneer alle van de vastgelegde beelden zijn omgezet van JP2 naar TIFF-bestanden, zijn ze klaar om te worden gebruikt voor analyse in ImageJ.
3. Met ImageJ, open alle van de beelden voor het eerste monster (vijf beelden in dit geval: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) en voeg ze als een afbeelding (Image Color → → Merge Channels). Herhaal dit proces voor elk van de monsters. Als alle monsters zijn gecombineerd als afzonderlijke beelden, het reinigen van de beelden door te selecteren ongewenste regio's met het "Polygoon Selections" tool en vullen ze in (Bewerken → Fill). (Wijzig het formaat van foto's naar een kleiner formaat, indien nodig). Maak vervolgens van elk beeld in een RGB-kleuren afbeelding (Image Type → → RGB-kleur). Tot slot, maak een stapel uit de beelden (Afbeelding → Stacks → afbeelding om Stacks), waarna ze verder kan worden afgestemd op de "Stack Reg" plug-in, indien nodig. Uiteindelijk, het samenvoegen van de kanalen en dan het combineren van de beelden creëert een 3D-montage van alle eilandjes in de gehele alvleesklier. Om de afbeelding, klik op "Plugins" en dan "3D-viewer."

4. Islet Mapping

Verzamelen Afbeeldingenstapels

1. Situeren de ganse berg pancreaseilandjes onder de microscoop.
2. Open de Slidebook software. Toegang tot de "Capture and Control Focus" door te drukken op "Ctrl + Shift + E." In de "Focus Control"-venster, de doelstelling geformuleerd om 20X of 40x, afhankelijk van de grootte van het eiland. Van toepassing zijn water bij gebruik van een water-immersie objectief lens.
3. Met het oog op de microscoop oculair te gebruiken om eilandjes te vinden, stelt u "Bin" om 2X en zet de Filter Set om Gebruiker1 in de "Focus Controls" venster. "Emission Selection" moet worden ingesteld op 100% Ogen en Neutral Density op 1. Klik op "GFP ey" en dan "Open Fluor."
4. Te visualiseren het monster in Slidebook, terug te keren naar de Focus Controls venster en schakel "Filter Set" op "Live" en klik op "GFP ds." Gebruik de joystick om het eilandje midden in de camera een raam zo goed mogelijk. Focus op een diepte ergens nabij het centrum van het eilandje, waar de cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden.
5. In de "Focus Controls Window", selecteer het "Z tabblad." Klik in de linkerbovenhoek van het venster om de huidige diepte in te stellen als een referentiepunt. Gebruik het scope controle om naar de bovenste diepte van het eilandje in welke functies duidelijk kan worden onderscheiden en klik op "set-top." Scroll naar de onderkant van het eiland in en klik op "Instellen Bottom." Klik op "Go" om terug te keren naar het referentiepunt.
6. In de Capture-venster, zet u "Bin Factor" naar "2X" en zet "Filter Set" naar "Live". Stel het "Capture type" naar "3D" (en enige 3D). Aan de rechterkant van het venster, klikt u op 'Gebruik Boven en Onder posities. " Klik op "Return to Point Na Capture Reference." Stel de "Step Size" naar "3."
7. Onder de "Filter Set Box," te selecteren DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU, en Cy5 DSU. Voor ieder een, klikt u op "beste te vinden" onder "Belichting aanpassen 'en vervolgens op" Test "om ervoor te zorgen dat de gekozen belichting geschikt is. Klik op "Start" om de vangst te beginnen.
8. Als de opname is voltooid, stelt u de niveaus als nodig en de weergegeven kleur voor RFP naar wit. Sla de slide en ga naar → Exporteren → TIFF-serie View. Typ de naam van de dia met een streepje aan het einde en sla het op. Tientallen individuele TIFF-bestanden worden gemaakt, dus het kan handig zijn om elke eilandje het imago van stapel te houden in een aparte map.

Mapping Afbeeldingenstapels

1. Open Stereo Investigator. Visualiseer het beeld door het openen van het beeld stacks (File → Afbeelding Stack → Afbeelding Stack Open). In de "Image Scaling menu," set "afstand tussen Images" naar 3,00 micrometer. Om te corrigeren voor 2X binning in Slidebook, selecteer dan "overschrijven X en Y Scaling" en "Gebruiker gespecificeerd voor Bron van X en Y" Scaling en voer 0,65 voor zowel X en Y.
2. Midden van de afbeelding door te klikken in het midden van het eilandje van belang in de "Macro-venster." Mark ten minste een cel met de juiste markering. Beta-cellen groen verschijnen, zal alfa-cellen verschijnen, rood, en delta-cellen zal verschijnen witte, gebruik Marker 2 (een holle cirkel) om beta-cellen, Marker 5 (een holle driehoek) merk alfa-cellen markeren, en Marker 6 ( een holle driehoek) tot delta-cellen. De cellen moeten worden gemarkeerd in het centrum van hun kern, die zal verschijnen blauw als het monster is gekleurd met DAPI.
3. Zodra ten minste een cel is gemarkeerd, geeft u de "Orthogonal View" met behulp van het pictogram in het hoofdmenu. Check "Z-Filter" en "Symmetrisch". Het assortiment should worden ingesteld op 15,00. Beginnend bij de 0.0 Z-niveau, bladert u door het eilandje met de muis wiel en markeer elke cel met de juiste markering. Elke cel mag slechts eenmaal worden gemarkeerd in het centrum van de diepte. Bij het afwerken op iedere van de Z-niveaus, de "Z-filter" vakje kan worden uitgeschakeld. Deze toont alle van de markeringen van alle van de Z-niveau.
4. Als elke cel is gemarkeerd, wordt het bestand opslaan als een "DAT" bestand, ga dan naar → Exporteren Tracing File. Sla de tracing als een "TXT" bestand. Klik op "Nieuwe gegevens File" om de werkruimte te wissen voordat u probeert om nieuwe eilandjes kaart.

5. Representatieve resultaten:

De voorbereiding van Virtual Schijfjes uit een immunohistochemisch gekleurde pancreas monster in staat stelt een te onderzoeken alle van de endocriene cellen (alfa, beta en delta-cellen) in het hele alvleesklier, zowel samen als eilandjes (Figuur 1A) en individueel in aparte kanalen ( Figuur 1B). Met de hulp van computerprogramma's en scripts, kan een massa-analyse van grootschalige data worden uitgevoerd op deze Virtual Slices. In het bijzonder, een analyse van deeltjes van composiet maskers (figuur 1C) is uitgevoerd als een tabel met statistieken die dergelijke parameters als eilandje oppervlakte, omtrek (de afstand rond een gebied), rondheid (een zekere mate van rondheid, waarbij 1,0 staat voor een perfecte cirkel) en Feret diameter van (de langste afstand binnen een gebied) voor elk eilandje ontdekt (figuur 1D). De grootschalige analyse van deze beelden resulteert in de productie van het totale aantal eilandje en de grootteverdeling histogrammen, evenals een gedetailleerde vergelijking van alfa-, bèta-, delta-en-cel gebieden. Daarnaast wordt elke Virtual Slice genomen op een diepte van ongeveer 5 micrometer, en al van de individuele 2D Virtual Schijfjes zijn verder gestapeld tot een 3D-reconstructie van het gehele pancreas monster te creëren. Eilandje in kaart brengen toont een ander voorbeeld, niet alleen van het vastleggen van eilandjes in 3D, maar ook van gedetailleerde computer-ondersteunde analyse. Eilandje in kaart brengen bestaat uit het vastleggen van de verschillende eilandjes (Figuur 2A) en de daaropvolgende markering van alfa-, bèta-, delta-en-cellen op verschillende Z-vliegtuigen (figuur 2B) op een eilandje in 3D (figuur 2C, D) te visualiseren. Geautomatiseerde wiskundige analyse van in kaart gebracht eilandjes displays hun cellulaire samenstelling en architectuur, met inbegrip van cel-cel afstanden (figuur 2E) en cumulatieve kansen van cel-cel op afstand distributies (figuur 2F).

Figuur 1. Grootschalige afvang en analyse van eilandje distributie via Virtual Slice. A. Virtual slice weergave van een menselijke pancreas sectie. a. Immunohistochemische kleuring voor insuline (groen), glucagon (rood), somatostatine (wit) en DAPI (blauw). b. Omgerekend 8-bit masker na automatische drempelwaarden. Een boxed gebied is vergroot in BB Views van elk kanaal. a. delta-cellen, b. beta-cellen, c. alfa-cellen, en d. samengevoegd samengestelde afbeelding. C. Particle analyse uitgevoerd op composiet masker. Merk op dat elke eilandje structuur met inbegrip van kleine cel clusters is genummerd (blauwe markering). D. Statistieken tabel met verschillende parameters gemeten voor individuele structuren, die id's die overeenkomen met labels aangegeven in C hebben

Figuur 2. Analyse van de immunohistochemische Virtual Slice. A. 3D scatterplot van figuur 1 toont grootte en vorm distributie van elke eilandje door parameters zoals het gebied, circulariteit en Feret de diameter. B. 3D scatterplot van figuur 1 toont cellulaire eilandje samenstelling en omvang. C. Islet grootteverdeling van de gehele menselijke sectie analyse van Figuur 1 gemonteerd op een lognormale kansdichtheid distributie. D. Wiskundige analyse van de cellulaire samenstelling van ratio's (beta-cellen in het groen, alfa-cellen in het rood en delta-cellen in het blauw) voor elke eilandje effectieve diameter bak van Figuur 1. E. a. Eilandje grootteverdeling van de steekproefsgewijze immunohistochemische analyse (links). Eilandje grootteverdeling van de virtuele slice analyse (rechts). b. Log-normale plot vergelijking van de steekproefsgewijze immunohistochemische analyse (rood) en virtuele slice (blauw).

Figuur 3. Islet in kaart brengen en wiskundige analyse van de cellulaire samenstelling en architectuur. A: Screen-capture met een focal plane van een 3D-gereconstrueerde stapel van beelden van een menselijk eilandje geüpload naar Stereo-Investigator (beta-cellen in het groen, alfa-cellen in het rood, delta-cellen in het wit, en de kernen in het blauw) . B: Fluorescentie beelden (links) en bijbehorende gegevens in kaart gebracht (rechts) in drie verschillende focale vliegtuigen getoond met een interval van 10 urn. C: representatief beeld van 3D gereconstrueerd eilandje kaartgegevens. D: 3D reconstructie van de wijk-gesneden eilandje op basis van de coördinaten verkregen door het eilandje in kaart brengen. E: Wiskundige analyse van cellulaire samenstelling en architectuur. Left. Relatieve frequentie van cel-cel afstanden tussen twee cellen in een enkele cel populatie. Rechts. Relatieve frequentie van cel-cel afstanden tussen twee verschillende celpopulaties. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) te testen. Links. Cumulatieve kansen van cel-cel op afstand distributies voor alfa-to-alpha, beta-to-beta en delta-to-delta cellen. Rechts. KS afstanden voor de corresponderende drie cumulatieve kansen.

De computer-assisted grootschalige visualisatie en kwantificatie hier gepresenteerde veroorloven vier belangrijke punten in eilandjes van Langerhans studies: (1) Een grootschalige analyse van de alvleesklier exemplaren biedt een uitgebreid overzicht van de totale omvang eilandje distributie en eilandje architectuur. (2) De 3D reconstructie en wiskundige analyse van de cellulaire samenstelling en architectuur verder vergemakkelijken het onderzoek naar de ruimtelijke rangschikking van de endocriene cellen binnen een eilandje. (3) Opvallend eilandje plasticiteit tussen de verschillende soorten en in dezelfde soort onder verschillende pathofysiologische omstandigheden kan wijzen op evolutionair verworven aanpassing in reactie op de metabole veranderingen, in plaats van soorten verschillen. (4) Herinrichting van endocriene cellulaire samenstelling en eilandje architectuur, samen met veranderingen in bepaalde genexpressie, kan een afspiegeling eilandje aanpassing in de functionele eigenschappen, die verder wijst op het belang van de rol van de intraislet endocriene cel-netwerk.