JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

1,2, 1, 1

1Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Cellular and Molecular Pathology, School of Medicine, University of Pittsburgh

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.83.230.137, User IP: 54.83.230.137, User IP Hex: 911468169

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Pulmoner farelerin solunum yolu epitel hücreleri izole ve farklılaşmış bir solunum yolu epitel bir model olarak hava-sıvı arayüzü kültüre olabilir. Bu çevresel toksin moleküler yanıtların incelemek üzere bir protokol, tecrit, kültür ve bu hücreler ana sigara dumanına maruz için tarif edilir.

    Date Published: 2/21/2011, Issue 48; doi: 10.3791/2513

    Cite this Article

    Lam, H. C., Choi, A. M., Ryter, S. W. Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface . J. Vis. Exp. (48), e2513, doi:10.3791/2513 (2011).

    Abstract

    Akciğer epitel hücreleri farelerin solunum yolu ve hava-sıvı arayüzü (ALI), farklılaşmış solunum yolu epitel bir model olarak kültüre izole edilebilir. CS maruz epitel hücre yanıtlarını araştırmak için bir protokol, ana sigara dumanı (CS) bu hücreler izole etmek ve sergilemek için tarif edilir. Fare trakea, hava-sıvı arayüzü (ALI) tam olarak farklılaşmış epitel hücreleri bu hücrelerin kültür ve kültür alanında bu hücrelerin kalibre ana CS teslim hava yolu epitel hücreleri izolasyonu: protokol üç bölümden oluşur. ALİ kültür sistemi, solunum yolu epitel kültürünü daha yakından sıradan sıvı kültür sistemleri daha fizyolojik ayar benzer koşullar altında izin verir. CS maruz kalma, moleküler ve akciğer hücresel yanıtları çalışmada, çevresel hava kirliliğinin insan sağlığı üzerindeki etkisini anlamak önemli bir bileşeni. Araştırma bulguları, bu alanda sonuçta kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve büyük küresel sağlık sorunları temsil eden diğer tütüne bağlı hastalıklar, etyolojisi anlamak yolunda katkıda bulunabilir.

    Protocol

    Genel protokol, hayvan doku, hücre çoğalması için 5-10 gün ve hava-sıvı arayüzü hücre farklılaşması için ek bir 10-14 gün için 2 gün hücre izolasyonların gerektirir. Ek bir gün hücre pozlama ve numune hasat için gereklidir.

    1. Fare Trakeobronşiyal Epitel Hücreleri (Mtec) izolasyonu.

    Not: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler ve Brigham ve Kadın Hastanesi / Harvard Tıp Okulu Alanı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

    Başlamadan önce:

    • Ham F12 Medya antibiyotik içeren hazırlayın. 250 ml Ham F12 bazal medya (Cellgro) 2.50 mL 100 X Penisilin / Streptomisin (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) solüsyonu, 1000 X Fungizone çözüm 250 mcL ekleyin . 4 haftaya kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.
    • % 0,15 Pronase bir çözüm hazırlayın. Ham F12 Medya antibiyotik içeren 10 ml için 15 mg Pronase ekleyin. Taze ve kullanana kadar buz üzerinde tutmak.
    • Temiz bir çalışma yüzeyine ve steril cerrahi aletler, küçük bir hayvan ameliyatı için uygun ve hücre izolasyonların için bir lamelli doku kültürü kaputu hazırlayın. Hayvan hücre kültürü için nemlendirilmiş CO 2 inkübatör, soğuk oda, masa hücre santrifüjler, ters mikroskop ve tek kullanımlık plastik pipet ve kültür eşya da dahil olmak üzere diğer tüm ekipmanları standart olarak kabul edilir.
    • Kollajen hazırlayın solüsyonu (0.02 N asetik asit, 50 mg / ml). 12 transwell plaka (Corning) her kuyuya Pipet 1.0 mL kollajen çözüm. Parafilm sarın ve oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde bir gece bekletin.
    1. Piyasada satılan bir fare suşu (eski, yani erkek 6-8 hafta C57BL / 6) kullanarak, fareler gibi CO 2-kaynaklı narkoz ötenazi onaylanmış bir yöntem kullanarak euthanize . Genelde 6 fareler 12-iyi transwell plaka tohum için yeterli hücreleri (1.5-2.0 x 10 5 hücre / fare) verecektir.
    2. Alanında sterilize etmek için 70% EtOH çözüm ile hayvan leşleri püskürtün.
    3. Temiz cerrahi makas, neşter ile trakeal alanı çevresinde deri kaldırmak ve trakea maruz. Karnın aç, sternum boyunca kesme ve göğüs kafesi kaldırmak. Trakea sonuna maruz kadar doku çıkarın.
    4. Buz üzerinde, antibiyotik içeren 30 ml Ham F12 medya içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirin tracheas.
    5. Steril bir lamel akış kaputu, antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren steril bir 100 mm Petri kabında trakeal doku transferi.
    6. Yavaşça steril forseps ve cerrahi makas ile bağ dokusu disseke.
    7. Durulamak için antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren yeni bir 100 mm Petri kabında trakeal doku aktarın. Tracheas lümen maruz dikey eksen boyunca kesin.
    8. 10 ml% 0,15 Pronase çözüm içeren 50 ml tüp tracheas aktarın ve 4 gece boyunca inkübe ° C
    9. Ikinci gününde, hazır bulundurun:
      • DNAz Ben çözümü hazırlayın. Içeren antibiyotikler -20 1 ml alikotları ve mağaza olun, 10 mg / ml Sığır Serum Albumin (BSA) stok solüsyonu 2 ml, 10 mg ve ham pankreas DNAz I. eklemek Ham F12 Medya ° C 18 ml (üzerinde çözülmüş Kullanmadan önce buz).
      • % 20 fetal sığır serumu (FBS) ile antibiyotik içeren Ham F12 ortamı hazırlayın. 200 ml Ham F12 bazal medya (Invitrogen) 50 ml ısı inaktive FBS 2.5 ml, 100 X Penisilin / Streptomisin (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) çözeltisi ve 250, 1000 X Fungizone çözüm mcL ekleyin .
      • Mtec Temel Orta antibiyotik içeren hazırlayın. 475,5 ml DMEM/F12 temel medya (Cellgro -) 7.5 mL 1 M Hepes çözüm, 200 mM glutamin çözüm, 2 mL% 7.5 NaHCO 3 çözümü, 100 X penisilin / streptomisin çözüm 5 ml, 10 ml, 500 mcL ekleyin 1000 X Fungizone çözüm
      • Mtec medium/10% FBS hazırlayın. Mtec temel orta antibiyotik içeren 45 ml, 5 ml ısı inaktive FBS ekleyin.
    10. Yavaşça tüp (Adım 1.8) 10-12 kez, rock ve sonra 4 oC de 30-60 dakika bekletin ° C.
    11. Tüp ve kaya 12 kez% 20 FBS ve antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya ekleyin.
    12. 3,% 20 FBS ve antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren 15 ml konik tüpler hazırlayın.
    13. Buz üzerinde bu çözüm bir kenara koyarak, Pronase çözüm tracheas çıkarın. Ham F12 içeren ilk konik tüp tracheas transferi ve tüp 12 kez ters. Bu işlem iki kez daha tekrarlayın.
    14. Biri 50 ml tüp içine adım 1.13 üç süpernatantlar Pronase çözüm birleştirin. Kalan doku atın.
    15. 4 dakika 10 ° C ve supernatant atmak için; 1400 Santrifüj (A-4-62 rotor ile donatılmıştır Eppendorf 5810R santrifüj 390 xg).
    16. Yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin, 1 ml DNAz çözüm pelet (100-200 mcL / trakea)ve 5 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
    17. 5 dakika 4 ° C ve supernatant atmak için 1400 (390 xg) santrifüjleyin.
    18. 8 mL Mtec orta% 10 FBS içeren hücre pelletini tekrar
    19. Primaria Plakalar Plaka hücre süspansiyonu (Falcon). 37 inkübe ° C% 95 hava atmosferi,% 5 CO 2, 5 saat (Not: Bu fibroblastlar için negatif bir seçim adım) .
    20. Plakalar hücre süspansiyonu toplayın ve 4 mL Mtec% 10 FBS içeren plakalar iki kez yıkayın. Havuz hücre süspansiyonu ve 50 ml konik bir tüp içinde birlikte yıkar.
    21. Sitospin ve hücre sayımı için 1 ml koruyun. 5,000 rpm (Eppendorf 5415D) 5 dakika için bir masaüstü santrifüj Spin. Kalan süpernatant 500 mcL ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Tripan Blue hayati boyama yöntemi kullanılarak hücre sayımı için 100 mcL kullanın. Sitospin analizi için 4 alikotları 100 mcL tasarruf
    22. 4, 1400 (390 xg) Spin kalan 15 ml hücre süspansiyonu ° C'de 10 dakika.

    2. Mtec Hava-Sıvı Arayüz, Yayılması ve türevleri

    Retinoik asit stok çözelti hazırlayın. Stok çözelti A:% 95 EtOH bir 5 mM stok solüsyonu yapmak için karanlıkta Retinoik asit (Bay 300,44 g / mol) tartılır. -80 ° C bir folyo sarılmış tüp içinde saklayın Gerektiğinde Hazır B çözeltisi (5 mcM), 50 mcL Menkul Kıymetler A, 500 mcL BSA çözüm (100 mg / ml) ve 49.5 ml Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek hazırlayın. Bir folyo ile muhafaza için -80 ° C'de 4 hafta kadar tüp tamamladı.

    Retinoik asit içeren Mtec çoğalması ortamı hazırlayın. Antibiyotik içeren 45,7 mL Mtec bazal medya için, 2.5 ml ısı inaktive FBS, 1 ml Retinoik asit Menkul Kıymetler B, 250 mcL İnsülin solüsyonu (2 mg / ml insülin 4 mM HCl), 250 mcL Epidermal büyüme faktörü çözüm (5 mg / eklemek , 1 mg / ml BSA içeren HBS ml EGF), 200 mcL sığır hipofiz ekstresi (HBS 1 mg / ml BSA içeren 15 mg / ml), 50 mcL Transferrin solüsyonu (HBS 1 mg / ml BSA içeren 5 mg / ml transferrin ), 50 mcL kolera toksin solüsyonu (HBS 1 mg / ml BSA içeren 100 mg / ml). Filtre son medya sterilize hazırlık ve hazırlık 2 gün içinde kullanın.

    1. Transwell plakaları kollajen çözüm çıkarın, kaputun altında 5 dakika boyunca bekletin ve PBS 2 kez yıkayın.
    2. Ardından santrifüj, proliferasyon medya (500 mcL) uygun bir hacmi de ortalama 7.5 x 10 4 -1.0 x10 5 hücre kaplama kolaylaştırmak için hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Transwell polikarbonat membran eklemek apikal yüzeye Pipet 500 mcL hücre süspansiyonu. 1,5 mL çoğalması medya transwell bazal bölmesine ekleyin.
    3. 37 batık Mtec kültürler inkübe ° C,% 95 hava içeren bir nemlendirilmiş inkübatör 7-10 gün için% 5 CO 2.
    4. Medya ilk kez değiştirmeden önce üç gün bekleyin. Her gün medya değiştirin. (EVOM Ohmvoltometer, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL), bir elektrot kullanarak transepitelyal hücre direnci görsel denetim ve ölçüm kültürler izleyin.
    5. Hücreleri konfluent görünür ve epitel direnci 1000 Ω / cm 2 ulaştığında, hücreler ALİ ayırt etmek için hazırız.
    6. % 2 NuSerum içeren Mtec bazal ortamı hazırlayın. % 2 V / V nihai konsantrasyonu Mtec temel orta NuSerum ekle Kullanmadan önce son konsantrasyonu 1 X 10 -7 M retinoik asit Menkul Kıymetler B ekleyin. Taze hazırlayın ve 2 gün içinde kullanın.
    7. Hücre apikal medya kaldırılması ve yerine% 2 Nuserum ve retinoik asit içeren 750 mcL Mtec bazal medya ile bazal medya, 10-14 gün için ayırt etmek için izin verin. Bazal medya değiştirin ve apikal tarafında% 2 NuSerum içeren Mtec her gün yıkayın.

    3. Sigara Duman Uygulama Kültür Epitel Hücreleri

    1. CS hücre poz sistemi (EMI Instruments, Pittsburgh, PA) kullanarak ana sigara dumanı transwell kültürlerin apikal tarafında Açığa. Cihazın fotoğraf için Bkz: Şekil 1. Teknik özellikler için özel reaktifler ve ekipman Tablo bakın. Kısacası, aparat, havalandırmalı bir pozlama odasına bağlı bir polipropilen hattı ana duman çizim ~ 7-8 ponponları her sigara içiyor peristaltik bir pompa oluşur. Maruz kalma odasında dolaşan su ° 37 ° C'de muhafaza ve% 5 CO 2 gaz hattı üzerinde bir atmosfer korunur. Hücreleri Kentucky 3R4F araştırma referans filtre sigara (Tütün Araştırma Enstitüsü, University of Kentucky, Lexington, KY) kullanarak dumanına maruz kalabilirler. Genelde hücrelerin toplam partikül madde (TPM) 100-200 mg / m 3 verimli 1-2 sigara dumanına maruz kalmaktadır. Kontrol kültürleri eşdeğer bir pozlama süresi oda havaya maruz kalır.
    2. TPM, TE ile birlikte üreticinin protokole göre ölçülür.-10c sigara makinesi (Teague'nin Şirketler). Kısaca, bir filtre (Pallflex) bir satır içi paslanmaz çelik tutucu bir sabit akış pompası (örnekleme birimi) için sigara içme odası örnekleme port önde gelen bir örnekleme tüp yerleştirilir. Bir çıkış tüp gaz sayacı (Kuru Gaz Sayacı, ONM61, 67, AEM) örnekleme birimi bağlanır. Filtre gaz örnekleme önce ve sonra tartılır. Mg filtre üzerinde biriken toplam malzeme örneklenir havanın toplam hacmi için normalize.
    3. Hücreler daha sonra herhangi bir zaman noktasında (örneğin, 0-24 saat) mesaj standart hücre analitik prosedürler için maruz kalma (yani Batı immunoblotting analizi, mRNA analizi, vb..) Ya da mikroskobu (yani, konfokal veya elektron mikroskobu) hasat edilebilir. Kültür ortamı da sitokinler veya sitotoksisite deneyleri için LDH serbest için analiz edilebilir.

    4. Temsilcisi Sonuçlar

    ALİ başarılı epitel izolasyon, proliferasyon ve farklılaşma bir arnavut kaldırımlı morfolojisi ile sağlam bir tek tabaka boyun eğmek zorundadır. Sağlıklı kültürlerin Transepithelilal hücre direnci yaklaşık 1000-2000 Ω / cm 2 olmalıdır. Şekil 2 fare solunum yolu epitel hücreleri, kontrol koşulları altında ve sigara dumanına maruz kaldıktan sonra, epitel hücre ve kirpikler belirteçler için lekeli bir tek tabaka gösteriyor. Şekil 3 ultrastrüktür ve kirpikler morfoloji gösteren, sağlıklı Mtec kültürlerin temsilcisi elektron mikrograflar gösterir.

    Şekil 1
    Şekil 1 üç faz, bir izolasyon adım, bir yayılma aşamasında, ve bir farklılaşma aşamasında hava-sıvı arayüzü (düzeni) ile epitel hücreleri gelirleri hazırlanması. Epitel hücreleri, fare batık kültürü yayılmaya transwells üzerine numaralı seribaşı trakea, izole edilmiş, ve sonra tam olarak ayırt hava-sıvı arayüzü dönüştürülür. Deneyler genellikle sürekli kültürün 24. gününde yapılmaktadır. Resmi kültür hücreleri ana sigara dumanına maruz kalma için bir model sistem gösteriyor. Transwell ALİ kültür sistemi, sıcaklık, nem ve CO 2 kontrollü özel modüler sigara dumanı dağıtım sistemi içine yerleştirilir .

    Şekil 2
    Şekil 2 Epitel hücre kültürleri sabit ve lekeli çekirdekleri (Hoechst 33.258), F-aktin (yeşil; Alexa Fluor 488-konjuge Phalloidin) ve kirpikler işaretleyici asetillenmiş α-tubulin (kırmızı, Cy3-konjuge sekonder antikor). Alt paneller, 4 saat sigara dumanına (2 sigara, 150 mg / m 3) maruz kalmaktan sonra alınan epitel hücreleri eşdeğer görüntüleri göstermek. (B) Laktat dehidrogenaz (LDH) yayın gösterildiği gibi sigara dumanı değişen dozlarda maruz kalma 24 saat sonra bazal ortamda ölçüldü.

    Şekil 3
    Şekil 3 fare trakeal epitel epitel hücreleri izole Hava-sıvı arayüzü kültürler, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bazal ve non-siliyalı tüycüklü hücreleri 1 özelliklere sahip çok sayıda alt tipi ayırt . Bu hücreler, yalancı solunum yolu epitel örneğini oluşturmaktadır. Şekil etiketler karşılık: bb: Bazal vücut, bir axoneme m: mitokondri, n: nükleus, s: substratı (polikarbonat membran), mv: microvili

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fare trakeal epitel hücreleri izole açıklayan protokol 1, Sen ve ark protokolleri adapte ve diğer modifikasyonlar ile 2-3. Hücre izolasyonların açıklayan herhangi bir protokol olduğu gibi, en kritik yönü, sıkı aseptik teknikler kullanılarak bakteriyel veya fungal patojenlerin bulaşmasını önlemek için. Ikinci bir kritik adım fibroblast tracheas dikkatli diseksiyon ile önlenebilir kültürlerin kirlenme, Adım 1.19 açıklandığı gibi negatif seçim önlemek için. Kültürleri, kültürler, izlenir, yıkanmış ve kültür ortamı, ilk 72 saat inkübasyon sonrası, her gün doldurulan olduğunu tam ALI başlangıcından itibaren yaklaşık iki hafta içinde ayırmak gerekir.

    Kronik sigara dumanına maruz kalma büyük ölçüde neden olan kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), büyük bir küresel sağlık sorunu 4-7 temsil etmeye devam edecektir. KOAH, ilerleyici hava akımı kısıtlılığı, yıkıcı alveol kaybı (amfizem) ve 4-7 sigara dumanı akciğer abartılı inflamatuar yanıtlar ile karakterize edilir. Çalışmaların çok sayıda CS modeli akciğer hücre yanıtlarını girişimi için alveoler, bronş ve hava yolu epitel hücresi sistemleri kullandık. Bu çalışmaların çoğu epitel hücre veya dönüştürülmüş hatları (yani, Beas-2b) yapılmıştır refs örnekler için 8-11, bkz. ALİ transwell kültür sistemi, daha geleneksel sıvı (batık) kültür 1-3 sağlanabilir, solunum yollarında fizyolojik yönlendirme yakın moda pulmoner epitel hücrelerinin kültürü sağlar . Özellikli protokol fare trakeal primer kültürlerinde 1, bu sistemin uygulama açıklar olsa da, ilke olarak, diğer birincil epitel hücreleri (örneğin, fare Tip II epitel hücreleri, İnsan bronşiyal epitel hücreleri, vb) uygulanabilir . Hücre kültürleri canlı ana CS uygulama belki de daha yakından CS maruz 12-15 hücresel çalışmalar yaygın kullanılan sulu sigara dumanı ekstraktı (CSE), uygulaması daha CS insan maruz kalma yaklaşık bir model temsil eder . CSE, bütün duman birçok kimyasal bileşenleri yoksun ana duman çözünebilir bir bölümünü temsil etmektedir. Hem CS pozlama sistemleri sınırlamalar olsa da, CSE bu yana tek bir hazırlık birden fazla deneyler için kullanılabilir, daha kolay kalibre olmanın avantajı vardır, ve dozaj seyreltme 15-16 sağlanır . Öte yandan, burada ana duman teslim TPM ölçümlere göre ölçülmesi için bir yöntem sayılabilir. Toksinlere maruz kalma, moleküler ve hücresel yanıtların aydınlatılması, özellikle CS olarak bu makalede örneklediği, özellikle akciğer, kronik hastalıkların etiyolojisi anlayış, hava kirliliğinin insan sağlığı üzerindeki etkisi daha fazla olacaktır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgements

    Biz değerli uzmanlık için teknik yardım ve Dr. Shivraj Tyagi Emeka Ifedigbo teşekkür ederim. Ayrıca Harvard NeuroDiscovery Merkezi mikroskobu ile yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, bir Amerikan Kalp Birliği tarafından hibe 09PRE2250120 Hilaire Lam ve AMK Choi verilen NIH hibe R01-HL60234 R01-HL55330 R01-HL079904 predoctoral kısmen desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ham’s F12 Medium 1X Cellgro MT-10-080-CM With L-glutamine
    Pen/strep Lonza Inc. 17-602E
    Pronase Roche Group 10165921001 Streptomyces griseus
    Collagen I BD Biosciences 354236 From rat tail
    Acetic Acid Sigma-Aldrich 338826-25
    DNaseI Sigma-Aldrich DN25-100MG From Bovine Pancreas
    Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605-100 Fraction V
    Retinoic Acid Retinoic Acid R265-50MG
    Hank’s Balanced Salt Solution GIBCO, by Life Technologies 14175 Without Ca++ or Mg++
    DMEM-F12 Cellgro MT-15-090-CM Without L-Glutamine or HEPES
    HEPES, 1M in H2O Sigma-Aldrich 83264-100ML
    L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513-100ML 200 mM
    Amphotericin B (Fungizone) Fisher Scientific 1672346
    Insulin Sigma-Aldrich 16634-50MG Bovine Pancreas
    Apo-transferrin (human) Sigma-Aldrich T1147-100MG
    Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 Vibrio Cholerae
    Epidermal growth factor BD Biosciences 354001 Mouse
    Bovine pituitary Extract BD Biosciences 354123
    NuSerum BD Biosciences 355100
    Transwell Corning 3401 12 mm, 0.4 mm Pore
    Polycarbonate
    Primaria 100 mm culture dish Falcon BD 353803
    Pallflex membrane Pall Corporation EMFAB TX40H120-WW
    Smoking Machine EMI Services ATCSALI-1 see Footnote*

    *The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.

    This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).

    References

    1. You, Y., Richer, E.J., Huang, T., & Brody, S.L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
    2. Davidson, D.J. et al. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 3 Suppl 2, 59-62 (2004).
    3. Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S.H., Sheppard, D.N., & Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
    4. Rabe, K. F., et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
    5. Macnee W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
    6. Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., & Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
    7. Yao H, Rahman I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
    8. van der Toorn, M., et al. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
    9. Slebos, D.J. et al. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
    10. Kim, H.P., et al. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy 4:7, 887-895 (2008).
    11. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE 3, e3316. (2008).
    12. Okuwa, K., et al., In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. 2009 [Epub ahead of print].
    13. St-Laurent, J., Proulx, L.I., Boulet, L.P., & Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
    14. Watson AM, Benton AS, Rose MC, & Freishtat RJ. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
    15. Rennard, S.I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
    16. Shapiro, S.D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).

    Comments

    2 Comments

    Do MTEC cells also attach on collagen POLYESTER covered inserts ?
    Reply

    Posted by: gianluca t.June 1, 2012, 4:41 PM

    Yes, you can collagen I coat the polyester transwells as described and the cells will attach and grow. There are a few differences between the polycarbonate and polyester membranes. Cells growing on the polyester wells had a higher TER. Upon smoke exposure the cells on the polyester seemed more susceptible to smoking induced cytotoxicity and detached more easily. Finally, there are some protein expression differences I noted early on when I was using both transwells. I do not know how to fully account for these differences, but I think it may have something to do with the way the collagen adheres to the polycarbonate versus polyester. I hope this helps. Good luck!
    Reply

    Posted by: Hilaire L.June 2, 2012, 8:20 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter