Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

O protocolo geral requer dois dias para isolamentos de células do tecido animal, 5-10 dias para a proliferação celular, e um adicional de 10-14 dias para a diferenciação de células no ar-líquido interface. Um dia adicional é necessário para exposições de células e colheita de amostras.

1. Isolamento de rato traqueobrônquica células epiteliais (MTEC).

Nota: Todos os procedimentos descritos abaixo foram analisados ​​e aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use em Brigham e do Hospital da Mulher / Área Harvard Medical School.

Antes de começar:

• Prepare F12 Ham mídia contendo antibióticos. F12 a 250 mL Ham da mídia basal (Cellgro) adicionar 2,50 mL de uma 100 X penicilina / estreptomicina (10 ² U/mL-10 ² mg / mL) e solução de 250 mL de uma solução 1,000 Fungizone X. Armazenar a 4 ° C por até 4 semanas.
• Prepare uma solução de pronase 0,15%. Adicionar 15 pronase mg a 10 mL de F12 Ham mídia contendo antibióticos. Faça fresco e manter em gelo até o uso.
• Prepare uma superfície de trabalho limpa e estéril de instrumentos cirúrgicos adequados para a cirurgia de pequenos animais, e uma capa de tecido para cultura lamelar isolamentos celular. Todos os outros equipamentos é considerada padrão para a cultura de células animais, incluindo umidificado incubadoras de CO _2, câmara fria, a célula de mesa centrífugas, microscópio invertido e pipeta de plástico descartáveis ​​e utensílios de cultura.
• Prepare solução de colágeno I (50 mcg / ml em 0,02 N de ácido acético). Pipetar 1,0 mL de solução de colágeno em cada poço de uma placa de 12 poços transwell (Corning). Embrulhe em parafilme e deixe descansar durante a noite em uma superfície plana em temperatura ambiente.

1. Usando uma cepa do mouse comercialmente disponíveis (ie, C57BL / 6, machos de 6-8 semanas de idade), euthanize camundongos usando um método aprovado de eutanásia como o CO ₂ induzida narcose. Tipicamente 6 ratos irá produzir células suficientes (1,5-2,0 x 10 ⁵ células / mouse) para uma semente bem-12 placa transwell.
2. Pulverizar as carcaças de animais com 70% de solução EtOH para esterilizar o campo.
3. Com limpa tesoura cirúrgica e bisturi, retire a pele ao redor da área traqueal, e expor a traquéia. Abrir o abdômen, corte ao longo do esterno, e remover a caixa torácica. Remover o tecido até o final da traquéia está exposto.
4. Traquéias lugar em um tubo cônico de 50 mL contendo 30 mL Ham F12 mídia contendo antibióticos, no gelo.
5. Em uma capela de fluxo laminar estéril, a transferência de tecido traqueal a um prato de 100 milímetros estéril Petri contendo 10 mL Ham F12 mídia contendo antibióticos.
6. Suavemente dissecar o tecido conjuntivo com uma pinça e tesouras cirúrgicas estéreis.
7. Transferência de tecido traqueal a um 100 milímetros nova placa de Petri contendo 10 mL Ham F12 mídia contendo antibióticos para enxaguar. Corte traquéias longo do eixo vertical para expor lúmen.
8. Traquéias transferência para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de solução pronase 0,15% e incubar overnight a 4 ° C.
9. No segundo dia, ter pronto:
   • Prepare uma solução de DNAse I. A 18 mL de F12 Ham mídia contendo antibióticos adicionar 2 mL de uma 10 mg / mL solução estoque de albumina sérica bovina (BSA), e 10 mg de petróleo pancreático DNAse I. Faça um alíquotas mL e armazenar a -20 ° C (descongeladas em gelo antes de usar).
   • Prepare F12 Ham de mídia contendo antibióticos com 20% de soro fetal bovino (FBS). F12 a 200 mL Ham da mídia basal (Invitrogen) adicionar 50 mL de calor FBS inativada, 2,5 mL de uma 100 X penicilina / estreptomicina (10 ² U/mL-10 ² mg / mL) solução, e 250 mL de uma solução 1,000 Fungizone X .
   • Prepare MTEC meio básico contendo antibióticos. Para 475,5 mL DMEM/F12 meios básicos (Cellgro) adicionar 7,5 mL de solução 1 M HEPES, 10 mL de solução 200 mM de glutamina, 2 mL de um 7,5% solução de NaHCO _3, 5 mL de uma 100 X penicilina / estreptomicina solução, 500 mL de uma solução 1,000 Fungizone X
   • Prepare MTEC% medium/10 FBS. A 45 mL de MTEC meio básico contendo antibióticos, adicionar 5 mL de calor FBS inativado.
10. Agite delicadamente o tubo (a partir do Passo 1.8) 10-12 vezes, e depois deixe repousar por 30-60 minutos a 4 ° C.
11. Adicionar 10 mL Ham F12 mídia contendo 20% FBS e antibióticos para o tubo e rock 12 vezes.
12. Prepare 3 15 mL tubos cônicos contendo 10 mL Ham F12 mídia contendo 20% FBS e antibióticos.
13. Remover traquéias de solução pronase, deixando de lado esta solução sobre o gelo. Transferência de traquéias de tubo cônico primeira contendo F12 Ham e inverter tubo de 12 vezes. Repita esse processo mais duas vezes.
14. Combine solução pronase com os três sobrenadantes do passo 1,13 em um tubo de 50 mL. Descartar tecido remanescente.
15. Centrifugar a 1400 rpm (390 xg; centrífuga Eppendorf 5810R equipado com um rotor A-4-62) por 10 min a 4 ° C, e descartar o sobrenadante.
16. Delicadamente ressuspender o sedimento em 1 mL de solução DNAse (100-200 mL / traquéia)e incubar 5 min no gelo.
17. Centrifugar a 1400 rpm (390 xg) por 5 min a 4 ° C, e descartar o sobrenadante.
18. Ressuspender o pellet celular em 8 mL contendo meio MTEC FBS 10%
19. Suspensão placa de célula de Placas Primaria (Falcon). Incubar a 37 ° C em uma atmosfera de ar de 95%, 5% de CO ₂ durante 5 horas (Nota: este é um passo seleção negativa para fibroblastos).
20. Coletar suspensão de células a partir de chapas e placas de lavar duas vezes com 4 mL MTEC contendo 10% FBS. Suspensão pool de células e lavagens juntos em um tubo cônico de 50 mL.
21. Conserve 1 mL para cytospin e contagem das células. Girar em uma centrífuga de mesa por 5 min a 5.000 rpm (Eppendorf 5415D). Remover 500 mL e ressuspenda sedimento em sobrenadante restante. Use de 100 L para contagem de células usando o método de coloração Trypan Blue vital. Conserve quatro alíquotas de 100 mL para análise cytospin
22. Girar restantes 15 mL suspensão celular em 1400 rpm (390 xg), a 4 ° C por 10 min.

2. Propagação e Diferenciação de MTEC No Ar Líquido de Interface

Preparar soluções estoque ácido retinóico. Solução estoque A: Pesar ácido retinóico no escuro (Mr 300,44 g / mol) para fazer uma solução estoque 5 mM em EtOH 95%. Loja em um tubo de alumínio envolto a -80 ° C. Conforme necessário, prepare Solução B (5 mM), adicionando 50 mL de Stock A, 500 mL de solução BSA (100 mg / mL) e 49,5 mL de Hank solução salina balanceada (HBSS). Armazenar em um tubo de papel alumínio envolto a -80 ° C por até 4 semanas.

Prepare MTEC meio de proliferação contendo ácido retinóico. Para 45,7 mL de mídia MTEC basal contendo antibióticos, adicione inativado pelo calor 2,5 mL FBS, 1 mL de ácido retinóico stock B, 250 mL de solução de insulina (2 mg / mL de insulina em 4 mM HCl), 250 mL de solução fator de crescimento epidérmico (5 mg / mL EGF em HBS contendo 1 mg / mL BSA), 200 mL extrato de pituitária bovina (15 mg / mL em HBS contendo 1 mg / mL BSA), 50 mL de solução Transferrina (5 mg / mL de transferrina no HBS contendo 1 mg / mL BSA ), solução de 50 mL da toxina da cólera (100 mg / mL em HBS contendo 1 mg / mL BSA). Filtro de esterilizar a preparação dos meios final e use dentro de 2 dias de preparação.

1. Remoção da solução de colágeno a partir de chapas transwell, deixe repousar sob o capô por 5 min, e lavar com PBS duas vezes.
2. Centrifugação seguinte, ressuspender o pellet celular em um volume adequado de proliferação da mídia (500 mL) para facilitar o revestimento de 7,5 x 10 ⁴ -1,0 x10 ⁵ células por poço. Pipetar 500 mL suspensão celular na superfície apical da inserção da membrana transwell policarbonato. Adicione 1,5 mL de mídia proliferação para o compartimento basal do transwell.
3. Incubar as culturas MTEC submersa a 37 ° C em uma incubadora umidificada contendo ar de 95%, 5% de CO ₂ para 10/07 dias.
4. Esperar três dias antes de mudar de mídia pela primeira vez. Mudança de mídia todos os dias. Monitor de culturas por inspeção visual e medição da resistência transepitelial célula usando um eletrodo (EVOM Ohmvoltometer, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL).
5. Quando as células aparecem confluentes e resistência epiteliais atinge 1.000 Ω / cm ^2, as células estão prontos para diferenciar a ALI.
6. Prepare MTEC media basal contendo NuSerum 2%. Adicionar NuSerum para MTEC meio básico para uma concentração final de 2% V / V. Adicionar B Stock ácido retinóico para uma concentração final de 1 X 10 ^-7 M antes de usar. Prepare fresco e usar dentro de 2 dias.
7. Permitem diferenciar células por 10-14 dias, através da remoção de mídia apical e substituindo os meios de comunicação basal com 750 mL MTEC media basal contendo 2% de ácido retinóico e Nuserum. Troque a mídia basal e lavar o lado apical com MTEC NuSerum contendo 2% a cada dois dias.

3. Aplicação da fumaça do cigarro para cultura de células epiteliais

1. Expor o lado apical das culturas transwell à fumaça do cigarro convencional usando um sistema de exposição de células CS (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Veja a Figura 1 para fotografia do aparelho. Consulte a Tabela de reagentes e equipamentos específicos para as especificações técnicas. Em resumo, o aparelho consiste de uma bomba peristáltica que fuma cada cigarro em ~ 7-8 puffs, desenho na fumaça principal em uma linha de polipropileno que está ligado a uma câmara de exposição ventilados. A câmara de exposição é mantida a 37 ° C por circulação de água, e mantida em uma atmosfera de 5% CO ₂ em uma linha de gás. As células podem ser expostas à fumaça usando Kentucky 3R4F pesquisa cigarros de filtros de referência (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Normalmente as células são expostas à fumaça de cigarros 1-2, cedendo 100-200 mg / m ³ de material particulado total (TPM). Culturas controle são expostos ao ar ambiente por um período de exposição equivalente.
2. A TPM é medida de acordo com o protocolo do fabricante fornecido com o TE-10c máquina de fumar (Empresas Teague). Em resumo, um filtro (Pallflex) é colocado em um suporte de aço inoxidável embutido em um tubo de amostragem líder do porto de amostragem na câmara de fumo a uma bomba de fluxo constante (unidade amostral). Um tubo de saída conecta a unidade de amostragem para um contador de gás (medidor de gás seco, ONM61, 67, AEM). O filtro é pesado antes e após a amostragem de gás. O total de material depositado sobre o filtro em mg é normalizado para o volume total de ar amostrado.
3. As células podem ser colhidas em qualquer ponto do tempo (ou seja, 0-24 horas) pós-exposição para os procedimentos de célula padrão analítico (ou seja, Western immunoblot análise, análise de mRNA, etc) ou microscopia (ie, microscopia confocal ou elétron). Os meios de cultura também pode ser analisado para liberação de citocinas ou LDH para ensaios de citotoxicidade.

4. Resultados representante

Isolamento epiteliais sucesso, proliferação e diferenciação no ALI deve render uma monocamada intacta, com uma morfologia de paralelepípedos. Resistência das células Transepithelilal de culturas saudáveis ​​deve ser de aproximadamente 1000-2000 Ω / cm ^2. A Figura 2 mostra uma monocamada de células epiteliais respiratórias do rato coradas para células epiteliais e marcadores de cílios em condições controle e após a exposição a fumaça do cigarro. A Figura 3 mostra micrografias eletrônicas representante de culturas saudáveis ​​MTEC, retratando ultraestrutura e morfologia dos cílios.

Figura 1. Preparação dos rendimentos células epiteliais através de três fases, uma etapa de isolamento, uma fase de propagação, e um estágio de diferenciação no ar-líquido interface (esquema). Células epiteliais são isolados de rato traquéia, semeados em transwells onde eles proliferam em cultura submersa, e depois convertido em ar-líquido interface onde eles totalmente diferenciar. Experimentos são normalmente realizados no dia ²⁴ de de cultura contínua. A imagem retrata um sistema modelo para a exposição de células cultivadas à fumaça de cigarro mainstream. Um sistema de cultura transwell ALI é colocado dentro de um sistema modular personalizado de entrega de cigarros de fumo que é controlado por temperatura, umidade e CO _2.

Figura 2 culturas de células epiteliais foram fixados e corados para núcleos (Hoechst 33258), F-actina (verde; Alexa Fluor-faloidina 488-conjugados). Cílios eo marcador acetilada α-tubulina (vermelho; anticorpos Cy3 conjugada secundário). Os painéis inferiores mostram imagens equivalentes de células epiteliais tomadas quatro horas após a exposição à fumaça de cigarro (2 cigarros, 150 mg / m ^3). (B) liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi medido no meio basal 24 horas após a exposição a doses variadas de fumaça de cigarro, conforme indicado.

Figura 3. Culturas Air-líquido de interface de células epiteliais isoladas do epitélio traqueal de rato se diferenciar em vários subtipos que, por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) tem as características de ciliadas, células basais, e não-ciliadas ^1. Estas células do epitélio respiratório pseudoestratificado tipificam. Rótulos figura correspondem a: bb: corpo basal, a: axonema, m: mitocôndrias, n: núcleo, s: substrato (membrana de policarbonato), mv: microvili

O protocolo descrevendo o isolamento de células epiteliais do mouse traqueal é adaptado dos protocolos de Você et al., ^{1, 2-3} e outros com modificações. Como acontece com qualquer protocolo de isolamento de células descrevendo, o aspecto mais crítico é o de evitar a contaminação por patógenos, bacteriana ou fúngica, utilizando técnicas de assepsia rigorosa. Um segundo passo fundamental é evitar a contaminação das culturas de fibroblastos, que podem ser evitados por meio de dissecção cuidadosa das traquéias, e seleção negativa, como descrito no passo 1.19. Desde que as culturas são monitorados, lavados, e os meios de cultura reabastecidos a cada dois dias após a incubação hora inicial de 72 anos, as culturas devem diferenciar completamente em aproximadamente duas semanas do início do ALI.

Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), que é em grande parte causada pela exposição crônica à fumaça do cigarro, continua a representar um problema de saúde mundial ^4-7. DPOC, é caracterizado por limitação progressiva ao fluxo aéreo, a perda alveolar destrutivos (enfisema), e exagerada resposta inflamatória do pulmão a fumaça de cigarro ^4-7. Um grande número de estudos têm utilizado alveolar, brônquios e das vias aéreas sistemas de células epiteliais para tentar respostas modelo de pulmão de células para CS. Muitos destes estudos foram realizados em células epiteliais ou linhas transformado (isto é, Beas-2b), ver Refs ^11/08 para exemplos. O sistema de cultura ALI transwell permite a cultura de células epiteliais pulmonares em moda que está mais próximo de sua orientação fisiológica nas vias aéreas, além do que pode ser fornecida pelo líquido convencional (submersa) cultura ^1-3. Embora o protocolo apresentado descreve a aplicação deste sistema ao mouse traqueal culturas primárias ^1, em outro princípio fundamental células epiteliais pode ser aplicado (isto é, células de camundongo Tipo II epiteliais, células epiteliais brônquicas humanas, etc.) A aplicação de viver principais CS às culturas de células representa um modelo que talvez mais se aproxima a exposição humana ao CS do que a aplicação do extrato aquoso fumaça de cigarro (CSE), que é comumente usado em estudos celulares de CS exposição ^12-15. CSE representa uma fração solúvel de fumaça mainstream que carece de muitos componentes químicos do fumo todo. Embora ambos os sistemas de exposição CS têm limitações, o CSE tem a vantagem de ser mais facilmente calibrados, desde uma preparação única pode ser usada para experiências múltiplas, e dosagem é obtida por diluição ^15-16. Por outro lado, incluímos aqui um método para quantificação de entrega fumaça principal com base em medições TPM. A elucidação das respostas moleculares e celulares para exposição a uma toxina, em particular CS como exemplificado neste artigo, ainda mais a compreensão do impacto da poluição atmosférica na saúde humana, em particular, a etiologia de doenças crônicas do pulmão.