Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

De algehele protocol vereist twee dagen voor de cel isoleren van dierlijk weefsel, 5-10 dagen voor de celproliferatie, en een extra 10-14 dagen voor de celdifferentiatie in lucht-water grensvlak. Een extra dag nodig is voor cel-blootstelling en het oogsten van de monsters.

1. Isolatie van Mouse tracheobronchiale epitheelcellen (MTEC).

Let op: Alle procedures die hieronder worden beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Brigham and Women's Hospital / Harvard Medical School Area.

Voordat u begint:

• Bereid Ham's F12 Media met antibiotica. Tot 250 ml Ham's F12 basale media (Cellgro) toe te voegen 2,50 ml van een 100 X penicilline / streptomycine (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) oplossing en 250 ul van een 1000 X fungizone oplossing. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
• Bereid een oplossing van 0,15% pronase. Voeg 15 mg pronase tot 10 ml Ham's F12 Media met antibiotica. Het maken van verse en blijf op ijs tot gebruik.
• Bereid een schoon werkoppervlak en steriele chirurgische instrumenten geschikt zijn voor kleine dieren een operatie, en een lamellaire weefselkweek kap voor cel-isolaties. Alle andere apparatuur wordt beschouwd als standaard voor dierlijke celkweek inclusief bevochtigde CO ₂ incubators, koude kamer, tafelblad cel centrifuges, omgekeerde microscoop, en wegwerp plastic pipet en cultuur ware.
• Bereid collageen I-oplossing (50 ug / ml in 0,02 N azijnzuur). Pipetteer 1,0 ml collageen oplossing in elk putje van een 12 goed transwell plaat (Corning). Wikkel in parafilm en laat een nacht staan ​​op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur.

1. Met behulp van een commercieel verkrijgbaar muizenstam (dat wil zeggen, C57Bl / 6, mannelijk 6-8 weken oud), euthanaseren muizen met een goedgekeurde methode van euthanasie, zoals CO _{2-geïnduceerde} narcose. Typisch 6 muizen levert genoeg cellen (1,5 tot 2,0 x 10 ⁵ cellen / muis) om zaad een 12-well transwell plaat.
2. Spray de kadavers met 70% EtOH-oplossing om het veld te steriliseren.
3. Met schone chirurgische schaar en scalpel, verwijder de huid rond de tracheale gebied, en bloot de luchtpijp. Open de buik, snijden langs het borstbeen, en verwijder de ribbenkast. Verwijder weefsel tot het einde van de luchtpijp wordt blootgesteld.
4. Plaats luchtpijpen in een 50 ml conische buis met 30 ml Ham's F12 media met antibiotica, op het ijs.
5. In een steriele lamellair stroom kap, transfer tracheale weefsel een steriele 100 mm petrischaal met 10 ml Ham's F12 media met antibiotica.
6. Voorzichtig ontleden bindweefsel met een steriele pincet en chirurgische schaar.
7. Overdracht tracheale weefsel een nieuwe 100 mm petrischaal met 10 ml Ham's F12 media met antibiotica te spoelen. Snijd luchtpijpen langs de verticale as naar lumen bloot te leggen.
8. Overdracht luchtpijpen om een ​​50 ml buis met 10 ml 0,15% pronase oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C.
9. Op de tweede dag, zijn er klaar voor:
   • Bereid een DNAse I-oplossing. Tot 18 ml Ham's F12 Media antibiotica toe te voegen 2 ml van een 10 mg / ml Bovine Serum Albumine (BSA) stock-oplossing, en 10 mg van ruwe pancreas DNAse I. Maak 1 mL porties en bewaar bij -20 ° C (ontdooid op ijs voor gebruik).
   • Bereid Ham's F12 media met antibiotica met 20% foetaal bovine serum (FBS). Tot 200 ml Ham's F12 basale media (Invitrogen) toe te voegen 50 ml warmte geïnactiveerd FBS, 2,5 ml van een 100 X penicilline / streptomycine (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) oplossing, en 250 ul van een 1000 X fungizone oplossing .
   • Bereid MTEC Basic Medium met antibiotica. Naar 475,5 mL DMEM/F12 basic media (Cellgro) toe te voegen 7,5 ml 1 M HEPES-oplossing, 10 ml 200 mM glutamine oplossing, 2 ml van een 7,5% NaHCO ₃ oplossing, 5 ml van een 100 X penicilline / streptomycine-oplossing, 500 pL van een 1000 X fungizone oplossing
   • Bereid MTEC medium/10% FBS. Tot 45 ml van MTEC basisch milieu met antibiotica, voeg 5 ml hitte geïnactiveerd FBS.
10. Schud de buis (vanaf stap 1.8) 10-12 keer, en laat het gedurende 30-60 minuten staan ​​bij 4 ° C.
11. Voeg 10 ml Ham's F12 medium met 20% FBS en antibiotica aan de buis en rock 12 keer.
12. Bereid 3 15 ml conische buisjes met 10 ml Ham's F12 medium met 20% FBS en antibiotica.
13. Verwijder de luchtpijpen van pronase oplossing, afgezien van deze oplossing op het ijs. Overdracht luchtpijpen de eerste conische buis met Ham's F12 en omkeren buis 12 keer. Herhaal dit proces nog twee keer.
14. Combineer pronase oplossing met de drie bovenstaande vloeistoffen van stap 1.13 in een 50 ml buis. Gooi de resterende weefsel.
15. Centrifugeer bij 1400 tpm (390 xg, Eppendorf-5810R centrifuge zijn uitgerust met een A-4-62 rotor) gedurende 10 min bij 4 ° C, en gooi supernatant.
16. Voorzichtig resuspendeer de pellet in 1 ml DNAse-oplossing (100-200 pi / luchtpijp)en incubeer 5 minuten op ijs.
17. Centrifugeer bij 1400 tpm (390 xg) voor 5 min bij 4 ° C, en gooi supernatant.
18. Resuspendeer de cel pellet in 8 ml MTEC medium met 10% FBS
19. Plaat celsuspensie op Primaria Platen (Falcon). Incubeer bij 37 ° C in een atmosfeer van 95% lucht, 5% CO ₂ voor 5 uur (Let op: dit is een negatieve selectie stap voor fibroblasten).
20. Verzamel celsuspensie van platen en twee keer spoelen platen met 4 ml MTEC met 10% FBS. Pool celsuspensie en wast samen in een 50 ml conische buis.
21. Conserve 1 ml voor Cytospin en cel tellen. Spin in een tabletop centrifuge gedurende 5 min bij 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Verwijder de 500 pL en resuspendeer pellet in resterende supernatant. Gebruik 100 ul voor mobiele tellen van het gebruik van de trypan Blue vitale kleuring methode. Conserve vier fracties van 100 ul voor Cytospin analyse
22. Spin overige 15 ml celsuspensie bij 1400 tpm (390 xg) bij 4 ° C gedurende 10 minuten.

2. Vermeerdering en differentiatie van MTEC Op Lucht-water interface

Bereid retinoïnezuur voorraad oplossingen. Stock oplossing A: Weeg Retinoïnezuur in het donker (de heer 300,44 g / mol) tot een 5 mM voorraad oplossing te maken in 95% EtOH. Bewaren in een folie gewikkeld buis bij -80 ° C. Indien nodig, voorbereiden Stock oplossing B (5 uM) door toevoeging van 50 ul Stock A, 500 pl BSA-oplossing (100 mg / ml) en 49,5 gebalanceerde zout mL Hank's oplossing (HBSS). Bewaren in een folie gewikkeld buis bij -80 ° C gedurende maximaal 4 weken.

Bereid MTEC proliferatie medium met retinoïnezuur. Tot 45,7 mL MTEC basale media met antibiotica, voeg 2,5 mL hitte-geïnactiveerd FBS, 1 mL Retinoïnezuur Stock B, 250 pl Insuline-oplossing (2 mg / ml insuline in 4 mM HCl), 250 pi epidermale groeifactor-oplossing (5 ug / mL EGF in HBS met 1 mg / ml BSA), 200 pi runderen hypofyse-extract (15 mg / ml in HBS met 1 mg / ml BSA), 50 pi transferrine-oplossing (5 mg / ml in HBS transferrine met 1 mg / ml BSA ), 50 il cholera toxine-oplossing (100 mg / ml in HBS met 1 mg / ml BSA). Filter steriliseren laatste media bereiding en het gebruik binnen 2 dagen van voorbereiding.

1. Verwijder de collageen-oplossing van transwell platen, laat staan ​​onder de motorkap voor 5 min, en wassen met PBS twee keer.
2. Na centrifugatie, resuspendeer de cel pellet in een geschikt volume van de proliferatie media (500 ui) om beplating van 7,5 x 10 ⁴ x 10 -1.0 ⁵ cellen per well te vergemakkelijken. Pipetteer 500 ui celsuspensie op het apicale oppervlak van de transwell polycarbonaat membraan te voegen. Voeg 1,5 mL van de proliferatie media om de basale compartiment van de transwell.
3. Incubeer de ondergedompelde MTEC culturen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 95% lucht, 5% CO ₂ voor 7-10 dagen.
4. Wacht drie dagen voor het veranderen media de eerste keer. Verandering media om de andere dag. Monitor culturen door visuele inspectie en meting van transepithele cel verzet met behulp van een elektrode (EVOM Ohmvoltometer, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL).
5. Wanneer de cellen samenvloeiende verschijnen en epitheliale weerstand bereikt 1,000 Ω / cm ^2, de cellen zijn klaar om te differentiëren op ALI.
6. Bereid MTEC basale medium met 2% NuSerum. Voeg NuSerum aan MTEC basisch medium tot een uiteindelijke concentratie van 2% V / V. Voeg retinoïnezuur Stock B tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 ^-7 M voor gebruik. Bereid verse en gebruik het binnen 2 dagen.
7. Laat cel om onderscheid te maken gedurende 10-14 dagen, door het verwijderen van apicale media en het vervangen van de basale media met 750 pi MTEC basale medium met 2% Nuserum en retinoïnezuur. Wijzig de basale media en was de apicale kant met MTEC met 2% NuSerum om de andere dag.

3. Toepassing van sigarettenrook op gekweekte epitheelcellen

1. Expose de apicale zijde van de transwell culturen om reguliere sigaret roken met behulp van een CS-cel-belichtingssysteem (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Zie Figuur 1 voor een foto van het apparaat. Zie tabel van specifieke reagentia en uitrusting voor technische specificaties. In het kort, het apparaat bestaat uit een peristaltische pomp die elke sigaret rookt in ~ 7-8 soezen, tekening in de mainstream rook in een polypropyleen lijn die is aangesloten op een geventileerde blootstelling kamer. De belichting kamer wordt gehandhaafd op 37 ° C door de verspreiding van water, en gehandhaafd op een atmosfeer van 5% CO ₂ op een gasleiding. De cellen kunnen worden blootgesteld aan de rook met behulp van Kentucky 3R4F onderzoek referentie-filter sigaretten (The Tobacco Research Institute aan de Universiteit van Kentucky, Lexington, KY). Typisch cellen worden blootgesteld aan de rook 1-2 sigaretten, waardoor 100-200 mg / m ³ van de totale fijn stof (TPM). Controle culturen worden blootgesteld aan lucht in de ruimte voor een gelijke periode van blootstelling.
2. De TPM is gemeten volgens protocol van de fabrikant die bij de TE-10c roken machine (Teague Enterprises). In het kort, is een filter (Pallflex), geplaatst in een inline RVS houder op een steekproef buis die vanaf de bemonstering-poort op de rookkamer om een ​​constante stroom pomp (monstername-eenheid). Een uitstroom buis verbindt de monstername-eenheid met een gasmeter (Droge gasmeter, ONM61, 67, AEM). Het filter wordt gewogen voor en na de gasmonsters. De totale materiaal afgezet op het filter in mg is genormaliseerd voor het totale volume van de lucht bemonsterd.
3. De cellen kunnen vervolgens worden geoogst op elk gewenst tijdstip (dat wil zeggen, 0-24 uur) na blootstelling aan voor de standaard mobiele analytische procedures (dat wil zeggen, West-immunoblot analyse, mRNA-analyse, enz.) of microscopie (dat wil zeggen, confocale of elektronenmicroscopie). De cultuur media kunnen ook worden geanalyseerd voor cytokinen of LDH release voor cytotoxiciteit assays.

4. Representatieve resultaten

Succesvolle epitheel isolatie, proliferatie en differentiatie bij ALI moet opleveren een intact monolaag met een geplaveide morfologie. Transepithelilal cel weerstand van gezonde culturen moet ongeveer 1000-2000 Ω / cm ^2. Figuur 2 geeft een monolaag van de muis respiratoire epitheelcellen gekleurd voor epitheliale cel en cilia markers onder controle omstandigheden en na de blootstelling aan sigarettenrook. Figuur 3 toont vertegenwoordiger electronenmicroscoop van gezonde MTEC culturen, voorstellende ultrastructuur en cilia morfologie.

Figuur 1. Voorbereiding van de epitheliale cellen verloopt via drie fasen, een isolatie stap, een vermeerdering podium, en een differentiatie stadium lucht-vloeistof interface (regeling). Epitheliale cellen geïsoleerd worden van de muis luchtpijp, gezaaid op transwells waar ze zich vermenigvuldigen in ondergedompelde cultuur, en vervolgens omgezet in lucht-water grensvlak, waar ze volledig te onderscheiden. Experimenten worden meestal uitgevoerd op de 24 ^ste dag van continue cultuur. De foto toont een modelsysteem voor de blootstelling van gekweekte cellen van de reguliere sigaret roken. Een transwell ALI cultuur-systeem is geplaatst in een op maat gemaakte modulaire sigarettenrook aflevering systeem dat wordt gecontroleerd voor temperatuur, vochtigheid en CO _2.

Figuur 2 Epitheliale celkweken werden gefixeerd en gekleurd voor de kernen (Hoechst 33258), F-actine (groen, Alexa Fluor-488-geconjugeerd Phalloidin). En de trilharen marker geacetyleerde α-tubuline (rood; Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam). De onderste panelen tonen equivalent beelden van epitheelcellen die 4 uur na de blootstelling aan sigarettenrook (2 sigaretten, 150 mg / m ^3). (B) Lactaat dehydrogenase (LDH) release werd gemeten in de basale medium 24 uur na blootstelling aan verschillende doses van sigarettenrook zoals aangegeven.

Figuur 3. Lucht-water grensvlak kweken van epitheliale cellen geïsoleerd uit muizen tracheale epitheel differentiëren in verschillende subtypes die door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) de kenmerken van de trilharen, basale, en niet-trilharen cellen ¹ hebben. Deze cellen typeren pseudostratified ademhalingsepitheel. Figuur labels komen overeen met: bb: basale lichaamstemperatuur, een: axoneme, m: mitochondria, n: kern, s: substraat (polycarbonaat membraan), mv: microvili

Het protocol beschrijft de isolatie van de muis tracheale epitheelcellen is een bewerking van de protocollen van U et al.., ^1, en ​​anderen ^2-3 met wijzigingen. Zoals met elk protocol beschrijft cel isolatie, het meest kritische aspect is om besmetting van bacteriën of schimmels te vermijden door gebruik te maken strikte aseptische technieken. Een tweede kritische stap is om te voorkomen dat fibroblast verontreiniging van de culturen, die kan worden vermeden door zorgvuldige dissectie van de luchtpijpen en negatieve selectie zoals beschreven in stap 1.19. Op voorwaarde dat de culturen worden bewaakt, gewassen, en de cultuur media aangevuld om de andere dag na de eerste 72 uur incubatie, moeten de culturen volledig te differentiëren in ongeveer twee weken vanaf de start van ALI.

Chronische obstructieve longziekte (COPD), die grotendeels wordt veroorzaakt door chronische blootstelling aan sigarettenrook, blijft vertegenwoordigen een grote wereldwijde gezondheidsprobleem ^4-7. COPD, wordt gekenmerkt door progressieve beperking van de luchtstroom, destructieve alveolaire verlies (emfyseem), en overdreven ontstekingsreacties van de long aan sigarettenrook ^4-7. Een groot aantal studies hebben gebruikt alveolaire, bronchiale, en luchtweg epitheelcellen systemen om te proberen het model long cel responsen op CS. Veel van deze studies zijn uitgevoerd in epitheliale cel of getransformeerd lijnen (dat wil zeggen, Beas-2b), zie Refs ^8-11 voor voorbeelden. De ALI transwell cultuur systeem maakt het mogelijk de cultuur van pulmonaire epitheelcellen in de mode, dat is dichter bij hun fysiologische oriëntatie in de luchtwegen, dan die, welke kan worden verstrekt door conventionele vloeistof (onderwater) cultuur ^1-3. Hoewel de aanbevolen protocol beschrijft de toepassing van dit systeem om de muis tracheale primaire culturen ^een, in principe andere primaire epitheliale cellen kan worden toegepast (dat wil zeggen, muis Type II epitheelcellen, Human bronchiale epitheelcellen, etc.). De toepassing van levende mainstream CS naar cel culturen is een model dat misschien beter benadert menselijke blootstelling aan CS dan de toepassing van waterige sigarettenrook extract (CSE), die veel gebruikt wordt in cellulaire studies van CS blootstelling ^12-15. CSE is een oplosbare fractie van mainstream rook dat veel chemische componenten van de hele rook ontbreekt. Hoewel beide CS blootstelling systemen hebben hun beperkingen, CSE heeft het voordeel dat het gemakkelijker gekalibreerd, omdat een enkel preparaat kan worden gebruikt voor meerdere experimenten, en de dosering wordt bereikt door verdunning ^15-16. Aan de andere kant hebben we ook hier een methode voor het kwantificeren van mainstream rook levering op basis van TPM meting. De opheldering van de moleculaire en cellulaire reacties op toxine blootstelling, in het bijzonder CS, zoals blijkt in dit artikel, zal verder het begrip van de invloed van luchtverontreiniging op de gezondheid van de mens, in het bijzonder het ontstaan ​​van chronische ziekten van de long.