Isolering av Mouse Respiratory epitelceller och exponering för experimentell cigarettrök på Air Liquid Interface

Det övergripande protokollet kräver 2 dagar för cell isoleringar från djurvävnad, 5-10 dagar för celldelning, och ytterligare 10-14 dagar för celldifferentiering vid luft-vätska gränssnitt. En extra dag krävs för cell exponeringar och skörd av prover.

1. Isolering av Mouse Tracheobronchial epitelceller (MTEC).

OBS: Alla som beskrivs nedan har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Brigham and Women sjukhus / Harvard Medical School Area.

Innan du börjar:

• Förbered Hams F12 Medier som innehåller antibiotika. Till 250 ml Hams F12 basala medier (Cellgro) lägg 2,50 mL av en 100 X Penicillin / streptomycin (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) och 250 mikroliter av en 1000 X Fungizone lösning. Förvaras vid 4 ° C i upp till 4 veckor.
• Bered en lösning på 0,15% Pronase. Tillsätt 15 mg Pronase till 10 ml av Hams F12 Medier som innehåller antibiotika. Gör frisk och hålla på is tills det ska användas.
• Förbered en ren arbetsyta och sterila kirurgiska instrument är lämpligt för små djur kirurgi och en lamellär vävnadsodling huva för cell isolering. All annan utrustning bedöms standard för djurens cellodling inklusive fuktas CO ₂ inkubatorer, kylrum, bordsskiva cell centrifuger, inverterat mikroskop, och de disponibla plastpipetten och kultur ware.
• Förbered kollagen Jag lösning (50 mikrogram / ml i 0,02 N ättiksyra). Pipettera 1,0 ml kollagen-lösning i varje brunn i en 12 väl transwell plattan (Corning). Wrap i parafilm och låt stå över natten på en plan yta vid rumstemperatur.

1. Med hjälp av en kommersiellt tillgänglig musstam (dvs C57BL / 6, hane 6-8 veckor gammal), euthanize mus genom användning av en godkänd metod för dödshjälp som CO _2-inducerad narkos. Normalt 6 möss kommer att ge tillräckligt med celler (1,5-2,0 x 10 ⁵ celler / mus) till utsäde ett 12-bra transwell plattan.
2. Spraya djurkadaver med 70% EtOH lösning att sterilisera fältet.
3. Med rena kirurgisk sax och skalpell, ta bort huden runt luftrör området och utsätta luftstrupen. Öppna buken, skär längs bröstbenet och ta bort bröstkorgen. Ta bort vävnaden fram till slutet av luftstrupe utsätts för.
4. Placera tracheas i ett 50 ml koniskt rör som innehåller 30 ml Hams F12 media som innehåller antibiotika, på is.
5. I en steril lamellkroppar flöde huva, överföring trakeal vävnad till en steril 100 mm petriskål innehållande 10 ml Hams F12 media som innehåller antibiotika.
6. Försiktigt dissekera bindväv med steril pincett och kirurgisk sax.
7. Överföring luftrör vävnad till en ny 100 mm petriskål innehållande 10 ml Hams F12 media som innehåller antibiotika för att skölja. Klipp tracheas längs vertikala axeln att avslöja lumen.
8. Överför tracheas till en 50 ml rör som innehåller 10 ml 0,15% Pronase lösning och inkubera över natten vid 4 ° C.
9. Den andra dagen, har klar:
   • Förbered en DNAse jag lösning. Till 18 ml av Hams F12 Media innehåller antibiotika tillsätt 2 ml av en 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) stamlösning, och 10 mg av råolja bukspottskörteln DNAse I. Gör 1 mL alikvoter och förvara vid -20 ° C (tinade om is före användning).
   • Förbered Hams F12 media som innehåller antibiotika med 20% fetalt bovint serum (FBS). Till 200 ml Hams F12 basala medier (Invitrogen) Tillsätt 50 ml värmeinaktiverad FBS, 2,5 ml av en 100 X Penicillin / streptomycin (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) och 250 mikroliter av en 1000 X Fungizone lösning .
   • Förbered MTEC Basic medium som innehåller antibiotika. Att 475,5 mL DMEM/F12 grundläggande media (Cellgro) Lägg 7,5 ml 1 M HEPES lösning, 10 ml 200 mM glutamin lösning, 2 ml 7,5% NaHCO _3-lösning, 5 ml en 100 X penicillin / streptomycin lösning, 500 mikroliter av en 1000 X Fungizone lösning
   • Förbered MTEC medium/10% FBS. Till 45 ml MTEC grundläggande medium innehållande antibiotika, tillsätt 5 ml värmeinaktiverad FBS.
10. Skaka röret (från steg 1,8) 10-12 gånger, och låt den stå i 30-60 minuter vid 4 ° C.
11. Tillsätt 10 ml Hams F12 media som innehåller 20% FBS och antibiotika till röret och rock 12 gånger.
12. Förbered 3 15 ml koniska rör med 10 ml Hams F12 media som innehåller 20% FBS och antibiotika.
13. Ta bort tracheas från Pronase lösning, att avsätta den här lösningen på is. Överföring tracheas till första koniska rör innehållande Hams F12 och invertera röret 12 gånger. Upprepa denna procedur två gånger till.
14. Kombinera Pronase lösning med tre supernatanterna från steg 1,13 till en 50 ml tub. Kassera återstående vävnad.
15. Centrifugera vid 1400 (390 xg, Eppendorf 5810R centrifug utrustad med en A-4 till 62 rotor) i 10 min vid 4 ° C, och kassera supernatanten.
16. Försiktigt resuspendera pelleten i 1 ml DNAse lösning (100-200 ml / luftstrupe)och inkubera 5 min på is.
17. Centrifugera vid 1400 (390 xg) i 5 minuter vid 4 ° C, och kassera supernatanten.
18. Resuspendera cellpelleten i 8 ml MTEC medium som innehåller 10% FBS
19. Tavla cellsuspension på primaria plattor (Falcon). Inkubera vid 37 ° C i en atmosfär av 95% luft och 5% CO ₂ för 5 timmar (OBS: detta är ett negativt urval steg för fibroblaster).
20. Samla cellsuspension från tallrikar och skölj tallrikar två gånger med 4 mL MTEC innehåller 10% FBS. Pool cellsuspension och tvättar tillsammans i en 50 ml koniska rör.
21. Bevara 1 ml för cytospin och cell räknar. Snurra i en bordsskiva Centrifugera i 5 min vid 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Ta bort 500 mikroliter och återsuspendera pelleten i återstående supernatant. Använd 100 mikroliter för cell räkna med Trypan Blå vitala färgningsmetod. Bevara 4 alikvoter av 100 mikroliter för cytospin analys
22. Spin resterande 15 fjädring ml cell vid 1400 (390 xg), vid 4 ° C i 10 min.

2. Förökning och differentiering av MTEC på Air flytande gränssnitt

Förbered retinoic lösningar syra lager. Stamlösning A: Väg Retinoinsyra i mörker (Herr 300,44 g / mol) för att göra en 5-lösning mM lager i 95% EtOH. Förvaras i ett inslagna folie rör vid -80 ° C. Som det behövs, förbereda B Stamlösning (5 M) genom att tillsätta 50 mikroliter Lager A, 500 mikroliter BSA-lösning (100 mg / ml) och 49,5 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Förvaras i folie lindade rör vid -80 ° C upp till 4 veckor.

Förbered MTEC spridning medium som innehåller retinoinsyra. För 45,7 ml MTEC basala media som innehåller antibiotika, lägga 2,5 mL värmeinaktiveras FBS, 1 ml Retinoinsyra Stock B, 250 mikroliter Insulin lösning (2 mg / ml insulin i 4 mm HCl), 250 mikroliter epidermal tillväxtfaktor lösning (5 mikrogram / mL EGF HUT innehåller 1 mg / mL BSA), 200 mikroliter nötkreatur hypofysen extrakt (15 mg / ml i HBS innehållande 1 mg / mL BSA), 50 mikroliter Transferrin lösning (5 mg / ml transferrin i HUT innehåller 1 mg / mL BSA ), 50 mikroliter koleratoxin lösning (100 mg / ml i HBS innehållande 1 mg / mL BSA). Filtrera sterilisera sista medier beredning och användning inom 2 dagar av förberedelser.

1. Ta bort kollagen lösning från transwell tallrikar, låt stå under huven i 5 minuter och tvätta med PBS 2 gånger.
2. Efter centrifugering, resuspendera cellpelleten i en lämplig volym av spridning media (500 mikroliter) för att underlätta plätering av 7,5 x 10 ⁴ -1,0 x10 ⁵ celler per brunn. Pipettera 500 mikroliter cellsuspension på apikala yta transwell polykarbonatmembranfilter infoga. Tillsätt 1,5 mL spridning media för att de basala facket i transwell.
3. Inkubera nedsänkt MTEC kulturer vid 37 ° C i en fuktig kuvös som innehåller 95% luft och 5% CO ₂ i 7-10 dagar.
4. Vänta tre dagar innan byte av media för första gången. Ändra media varannan dag. Övervaka kulturer genom okulär besiktning och mätning av transepithelial cellen motstånd med hjälp av en elektrod (EVOM Ohmvoltometer, World precisionsinstrument, Sarasota, FL).
5. När celler visas konfluenta och epiteliala motstånd når 1000 Ω / cm ^2, cellerna är redo att skilja på ALI.
6. Förbered MTEC basala media som innehåller 2% NuSerum. Lägg NuSerum till MTEC grundläggande medellång till en slutlig koncentration på 2% v / v. Lägg retinoic B syra lager till en slutlig koncentration av 1 x 10 ^-7 MSEK före användning. Bered en färsk och använd inom 2 dagar.
7. Låt cellen för att differentiera i 10-14 dagar, genom att ta bort apikala media och ersätta den basala media med 750 mikroliter MTEC basala medier innehållande 2% Nuserum och retinoinsyra. Ändra basala medier och tvätta den apikala sidan med MTEC innehållande 2% NuSerum varannan dag.

3. Tillämpning av cigarettrök till odlade epitelceller

1. Exponera apikala sidan av transwell kulturer att integrera cigarettrök med en CS-systemet cell exponering (EMI Instrument, Pittsburgh, PA). Se figur 1 för fotografi av apparaten. Se tabell av särskilda reagenser och utrustning för tekniska specifikationer. I korthet består apparater av peristaltiska pump som röker varje cigarett i ~ 7-8 puffar, rita i mainstream rök i en polypropylen linje som är ansluten till en portad exponeringskammare. Exponeringen kammaren bibehålls vid 37 ° C med cirkulerande vatten, och kvar på en atmosfär av 5% CO ₂ på en gasledningen. Cellerna kan utsättas för röken med hjälp av Kentucky 3R4F forskning referensfilter cigaretter (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Normalt celler utsätts för röken från 1 till 2 cigaretter, vilket ger 100-200 mg / m ³ av det totala partiklar (TPM). Kontroll kulturer utsätts för rumsluften för motsvarande exponeringstiden.
2. TPM mäts enligt tillverkarens protokoll medföljer TE-10c rökning maskin (Teague Enterprises). I korthet är ett filter (Pallflex) placeras i ett inline rostfritt stål hållare på en provtagning provrör som leder från provtagningen porten på rökning kammaren till ett konstant flöde pump (provtagning enhet). Ett utflöde röret ansluter urvalsenheten till en gasmätare (torr gas Meter, ONM61, 67, AEM). Filtret vägs före och efter provtagning av gas. Det totala materialet deponeras på filtret i mg normaliseras för den totala volymen provtas av luft.
3. Cellerna kan sedan skördas vid någon tidpunkt (dvs 0-24 timmar) efter exponering för standard cell analysmetoder (dvs västra immunoblot analys, mRNA analys, etc.) eller mikroskopi (dvs konfokala eller elektronmikroskopi). Den kultur media kan också analyseras för cytokiner eller LDH övergång till cytotoxicitet analyser.

4. Representativa resultat

Framgångsrika epitelial isolering, proliferation och differentiering vid ALI ska ge en intakt cellslager med kullersten morfologi. Transepithelilal cell motstånd friska kulturer bör vara ungefär 1000-2000 Ω / cm ^2. Figur 2 visar ett monolager av mus andningsorganen epitelceller färgas för epitelceller och markörer flimmerhår under kontroll förhållanden och efter cigarettrök exponering. Figur 3 visar representant elektron micrographs av friska MTEC kulturer, föreställande ultrastruktur och flimmerhår morfologi.

Figur 1. Beredning av epitelceller intäkterna genom tre faser, en isolering steg, en utbredning scen och en differentiering scenen på luft-vätska gränssnitt (systemet). Epitelceller är isolerade från mus luftstrupen seedade på transwells där de förökar sig i nedsänkt kultur, och sedan omvandlas till luft-vätska gränssnitt där de helt skilja. Experiment är vanligtvis utförs på ^{24: e} dagen av kontinuerlig kultur. Bilden föreställer en modell för exponering av odlade celler att integrera cigarettrök. En transwell ALI kultur-systemet placeras inuti en anpassad modulära cigarettrök leveranssystem som styrs av temperatur, luftfuktighet och CO _2.

Figur 2 epitelceller kulturer var fasta och färgas för kärnor (Hoechst 33.258), F-aktin (grön, Alexa-Fluor 488-konjugerat Phalloidin). Och flimmerhåren markör acetylerade α-tubulin (röd, Cy3-konjugerade sekundära antikroppar). Den nedre panelerna visar samma bilder av epitelceller tas 4 timmar efter exponering för cigarettrök (2 cigaretter, 150 mg / m ^3). (B) laktatdehydrogenas (LD) släpper uppmättes i bassubstratets 24 timmar efter exponering för varierande doser av cigarettrök som anges.

Figur 3. Luft-vätske-gränssnitt kulturer av epitelceller isolerade från mus trakeal epitel skilja på flera subtyper att genom att transmissionselektronmikroskop (TEM) har drag av cilierade, basala, och icke cilierade celler ^1. Dessa celler är typiska pseudostratified respiratoriska epitelet. Figur etiketter motsvarar: bb: basala kropp, ett: axoneme, m: mitokondrierna, n: kärna, S: substrat (polykarbonat membran), mv: microvili

Protokollet beskriver isolering mus trakeal epitelceller är anpassad från protokoll av dig et al., ^1, och andra ^2-3 med ändringar. Som med alla protokoll som beskriver cell isoleringar, är den mest kritiska aspekten att undvika kontamination från bakterie-eller svamppatogener genom att använda strikt aseptisk teknik. Ett andra viktigt steg är att undvika fibroblast kontaminering av kulturer, vilket kan undvikas genom noggrann dissekering av tracheas, och negativa urval som beskrivs i steg 1,19. Förutsatt att kulturer är övervakade, tvättade och kultur media fylls på varannan dag efter den första 72 timmars inkubation, bör de kulturer skilja helt i cirka två veckor från inledandet av ALI.

Kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), som till stor del orsakas av kronisk cigarettrök exponering, fortsätter att utgöra ett stort globalt hälsoproblem ^4-7. KOL, kännetecknas av progressiv obstruktivitet, destruktiva alveolära förlust (emfysem), och överdrivna inflammatoriska reaktioner i lungorna för att cigarettrök ^4-7. Ett stort antal studier har använt alveolär, bronkial och luftvägarna epitelceller system för att försöka cellmodell lung svar till CS. Många av dessa studier har utförts på epitelceller eller omvandlas linjer (dvs, Beas-2b), se Refs ^8-11 för exempel. ALI transwell kulturen systemet tillåter den kultur av pulmonell epitelceller i mode som är närmare deras fysiologiska orientering i luftvägarna, än den som kan tillhandahållas av konventionella flytande (nedsänkt) kultur ^1-3. Även om den presenterade protokollet beskriver tillämpningen av detta system till musen endotrakeal primärkulturer ¹ i princip andra primära epitelceller kan appliceras (dvs mus typ II epitelceller, mänskliga bronkial epitelceller, etc.). Tillämpningen av levande mainstream CS till cellkulturer är en modell som kanske mer lik människors exponering för CS än tillämpning av vattenlösning cigarettrök extrakt (CSE), som ofta används i cellulära studier av CS exponering ^12-15. CSE representerar en lösliga fraktionen av mainstream rök som saknar många kemiska komponenter i hela rök. Medan både CS exponering system har begränsningar, har CSE fördelen att vara lättare kalibreras, eftersom en enda preparatet kan användas för flera experiment, och dosering sker genom utspädning ^15-16. Å andra sidan inkluderar vi här en metod för att kvantifiera mainstream rök leverans bygger på TPM-mätningar. Klarlägga molekylära och cellulära svaren till toxisk exponering, särskilt CS som exemplifieras i denna artikel, kommer att öka förståelsen av effekterna av luftföroreningar på människors hälsa, särskilt etiologin av kroniska sjukdomar i lungan.