Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Die gesamte Protokoll benötigt 2 Tage für Zell-Isolierungen aus tierischem Gewebe, 5-10 Tage für die Zell-Proliferation und eine zusätzliche 10-14 Tage für die Zelldifferenzierung bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Ein weiterer Tag ist für die Zelle Engagements und der Ernte von Proben erforderlich.

1. Isolierung von Maus Tracheobronchial Epithelzellen (MTEC).

Hinweis: Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / Harvard Medical School Area.

Bevor Sie beginnen:

• Bereiten Ham 's F12 Medien mit Antibiotika. Bis 250 ml Hams F12 Basalmedien (CellGro) add 2,50 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin (10 ² U/mL-10 ² mg / mL) Lösung und 250 mL einer 1000 X Fungizone Lösung. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
• Bereiten Sie eine Lösung von 0,15% Pronase. Add 15 mg Pronase bis 10 ml Hams F12 Medien mit Antibiotika. Machen Sie frisch und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
• Bereiten Sie eine saubere Arbeitsfläche und sterile OP-Instrumente geeignet für Kleintier-Chirurgie, und eine lamellare Gewebekultur Haube für die Zell-Isolierungen. Alle anderen Geräte gilt als Standard für die tierische Zellkultur einschließlich befeuchteten CO _{2-Inkubatoren,} kalten Raum, Tisch-Zell-Zentrifugen, das inverse Mikroskop und Einweg-Kunststoff-Pipette und Kultur ware.
• Bereiten Kollagen I-Lösung (50 pg / mL in 0,02 N Essigsäure). Pipette 1,0 ml Kollagen-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well Transwell-Platte (Corning). Wrap in Parafilm und lassen Sie über Nacht stehen auf einer flachen Oberfläche bei Raumtemperatur.

1. Mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Mausstamm (dh C57Bl / 6, männlich 6-8 Wochen alt), euthanize Mäusen mit einem anerkannten Methode der Sterbehilfe, wie CO _2-induzierte Narkose. In der Regel 6 Mäusen erbringt genügend Zellen (1.5-2.0 x 10 ⁵ Zellen / Maus) das Seeding einer 12-well Transwell Platte.
2. Sprühen Sie die Tierkadaver mit 70% EtOH-Lösung, um das Feld zu sterilisieren.
3. Mit sauberen chirurgischen Schere und Skalpell, entfernen Sie die Haut um die trachealen Bereich, und setzen die Luftröhre. Öffnen Sie den Bauch, entlang des Brustbeins geschnitten, und entfernen Sie den Brustkorb. Entfernen Gewebe bis zum Ende der Luftröhre ausgesetzt ist.
4. Legen Sie Luftröhre in einen 50 mL konische Röhrchen mit 30 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika, auf Eis.
5. In einem sterilen lamellar-Haube, Transfer Luftröhrengewebe eine sterile 100 mm Petrischale mit 10 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika.
6. Sanft sezieren Bindegewebe mit einer sterilen Pinzette und chirurgische Schere.
7. Transfer Luftröhrengewebe, um eine neue 100 mm Petrischale mit 10 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika zu spülen. Cut Luftröhre entlang der vertikalen Achse zu Lumen aussetzen.
8. Transfer Luftröhre zu einem 50-ml-Tube mit 10 ml 0,15% Pronase-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
9. Am zweiten Tag haben bereit:
   • Bereiten Sie eine DNAse I-Lösung. Um 18 ml Hams F12 Medien mit Antibiotika 2 mL einer 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung und 10 mg rohes Pankreas DNAse I. mach 1 mL aliquotiert und bei -20 ° C (aufgetaut auf Eis vor der Verwendung).
   • Bereiten Ham 's F12 Medium mit Antibiotika mit 20% fötalem Rinderserum (FBS). Zu 200 ml Hams F12 Basalmedien (Invitrogen) mit 50 mL hitzeinaktiviertem FBS, 2,5 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin (10 ² U/mL-10 ² mg / mL) Lösung und 250 mL einer 1000 X Fungizone Lösung .
   • Bereiten MTEC Basismedium mit Antibiotika. Um 475,5 mL DMEM/F12 basischen Medien (CellGro) add 7,5 ml 1 M HEPES-Lösung, 10 ml 200 mM Glutamin-Lösung, 2 ml einer 7,5% NaHCO _3-Lösung, 5 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin-Lösung, 500 mL einer 1000 X Fungizone Lösung
   • Bereiten MTEC medium/10% FBS. Um 45 ml MTEC grundlegende Medium mit Antibiotika, 5 ml hitzeinaktiviertem FBS.
10. Schütteln Sie das Rohr (aus Schritt 1.8) 10-12 mal, und dann lassen Sie es für 30-60 Minuten stehen bei 4 ° C.
11. Fügen Sie 10 ml Hams F12 Medium mit 20% FBS und Antibiotika, um die Röhre und rock 12 mal.
12. Bereiten Sie 3 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml Hams F12 Medium mit 20% FBS und Antibiotika.
13. Entfernen Luftröhren von Pronase-Lösung, abgesehen von dieser Lösung auf Eis. Transfer Luftröhre zum ersten konischen Rohr mit Hams F12 und das Röhrchen 12 mal. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male.
14. Kombinieren Sie Pronase-Lösung mit den drei Überstände aus Schritt 1,13 in eine 50 ml Tube. Verbleibende Gewebe.
15. Zentrifugation bei 1400rpm (390 xg; Eppendorf 5810R-Zentrifuge mit einer A-4 bis 62 Rotor ausgestattet) für 10 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
16. Vorsichtig das Pellet in 1 ml DNAse-Lösung (100-200 ul / Trachea)und inkubieren 5 min auf Eis.
17. Zentrifugation bei 1400rpm (390 xg) für 5 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
18. Zellpellet in 8 ml MTEC-Medium mit 10% FBS
19. Platte Zellsuspension auf Primaria Platten (Falcon). Bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO ₂ für 5 Stunden (Anmerkung: Dies ist eine negative Selektion Schritt für Fibroblasten).
20. Sammeln Zellsuspension aus Platten und Spülen Platten zweimal mit 4 ml MTEC mit 10% FBS. Pool Zellsuspension und wäscht in einem 50 mL konischen Rohr.
21. Conserve 1 mL für Zytospin und Zellzählung. Spin in einer Tischzentrifuge für 5 min bei 5.000 rpm (Eppendorf 5415D). Nehmen Sie 500 mL und Pellet erneut in verbleibende Überstand. Verwenden Sie 100 ul zur Zellzählung mit dem Trypanblau Vitalfärbung Methode. Conserve 4 Aliquots von 100 ul für Zytospin Analyse
22. Spin restlichen 15 mL Zellsuspension bei 1400rpm (390 xg) bei 4 ° C für 10 min.

2. Vermehrung und Differenzierung von MTEC Bei Air-Liquid-Interface

Bereiten Retinsäure Stammlösungen. Stammlösung A: Wiegen Retinsäure in der Dunkelheit (Herr 300,44 g / mol) zu einer 5 mM Stammlösung in 95% EtOH zu machen. Shop in eine Folie eingewickelt Rohr bei -80 ° C. Bei Bedarf bereiten Stammlösung B (5 pM) durch Zugabe von 50 ul Stock A, 500 mL BSA-Lösung (100 mg / mL) und 49,5 ml Hanks balanced salt solution (HBSS). Shop in eine Folie eingewickelt Rohr bei -80 ° C für bis zu 4 Wochen.

Bereiten MTEC Verbreitung Medium mit Retinsäure. Auf 45,7 mL MTEC Basalmedien Antibiotika enthalten, fügen Sie 2,5 ml hitzeinaktiviertem FBS, 1 ml Retinsäure Lager B, 250 ul Insulin-Lösung (2 mg / ml Insulin in 4 mM HCl), 250 ul Epidermal Growth Factor-Lösung (5 g / mL EGF in HBS mit 1 mg / mL BSA), 200 ul Rinder Hypophysenextrakt (15 mg / mL in HBS mit 1 mg / mL BSA), 50 ul Transferrin-Lösung (5 mg / ml Transferrin in HBS mit 1 mg / mL BSA ), 50 ul Cholera-Toxin-Lösung (100 mg / mL in HBS mit 1 mg / mL BSA). Filter sterilisieren endgültigen Medien Herstellung und Verwendung innerhalb von 2 Tagen der Vorbereitung.

1. Entfernen Kollagenlösung von Transwell Platten stehen lassen unter der Motorhaube für 5 min, und waschen mit PBS 2 mal.
2. Nach der Zentrifugation Zellpellet in einem geeigneten Volumen der Proliferation Medien (500 mL), um plating von 7,5 x 10 ⁴ -1,0 x10 ⁵ Zellen pro Vertiefung zu erleichtern. Pipette 500 ul Zellsuspension auf der apikalen Oberfläche der Transwell Polycarbonatmembran einzufügen. Fügen Sie 1,5 ml der Proliferation Medien, um die basale Kompartiment des Transwell.
3. Inkubieren Sie die versunkenen MTEC Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 95% Luft, 5% CO ₂ für 7-10 Tage.
4. Warten Sie drei Tage vor wechselnden Medien die erste Zeit. Ändern Medien jeden zweiten Tag. Monitor-Kulturen durch visuelle Inspektion und Messung der transepithelialen Zellwiderstand mit einer Elektrode (EVOM Ohmvoltometer, World Precision Instruments, Sarasota, FL).
5. Wenn die Zellen konfluent erscheinen und epithelialen Widerstandes erreichte heute 1000 Ω / cm ^2, sind die Zellen bereit, bei ALI unterscheiden.
6. Bereiten MTEC Basalmedien mit 2% NuSerum. Add NuSerum zu MTEC Basismedium zu einer Endkonzentration von 2% V / V. Add Retinsäure Lager B bis zu einer Endkonzentration von 1 x 10 ^-7 M vor der Verwendung. Bereiten Sie frische und innerhalb von 2 Tagen.
7. Lassen Sie Zelle für 10-14 Tage zu differenzieren, indem apikalen Medien und Austausch der Basalmedien mit 750 ul MTEC Basalmedien mit 2% Nuserum und Retinsäure. Ändern Sie den Basalmedien und waschen der apikalen Seite mit MTEC mit 2% NuSerum jeden zweiten Tag.

3. Anwendung von Zigarettenrauch zu Cultured Epithelzellen

1. Expose der apikalen Seite der Transwell Kulturen Mainstream Zigarettenrauch mit einem CS Zellexposition System (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Siehe Abbildung 1 für Photographie des Apparates. Siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte für technische Spezifikationen. Kurz gesagt, besteht die Vorrichtung aus einer Schlauchpumpe, die jede Zigarette raucht in ~ 7-8 Züge, Zeichnung in den Mainstream Rauch in einem Polypropylen-Linie, die einen belüfteten Exposition Kammer verbunden ist. Die Exposition Kammer bei 37 ° C durch zirkulierendes Wasser, und bei einer Atmosphäre von 5% CO ₂ auf eine Gasleitung. Die Zellen können, um den Rauch mit Kentucky 3R4F Forschung Verweis Filterzigaretten (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY) ausgesetzt werden. Typischerweise Zellen sind, um den Rauch von 1 bis 2 Zigaretten ausgesetzt, wodurch 100-200 mg / m ³ von insgesamt Feinstaub (TPM). Control-Kulturen werden Raumluft und für ein gleichwertiges Expositionszeit ausgesetzt.
2. Das TPM ist nach dem Protokoll des Herstellers mit dem TE geliefert gemessen-10c Rauchmaschine (Teague Enterprises). Kurz gesagt, ist ein Filter (Pallflex) in ein Inline-Edelstahl-Halter auf einem Entnahmerohr, der von der Probenahme-Anschluss auf der Räucherkammer, um eine konstante Strömungspumpe (Abtasteinheit) platziert. Ein Abfluss Schlauch verbindet die Abtasteinheit eine Gasuhr (Dry Gas Meter, ONM61, 67, AEM). Der Filter wird vor und nach der Gasentnahme gewogen. Das gesamte Material abgelagert auf dem Filter in mg ist für das Gesamtvolumen der Luftproben normalisiert.
3. Die Zellen können dann zu jedem Zeitpunkt (dh, 0-24 Uhr) nach der Exposition für Standard-Zell-analytische Verfahren (dh, Western Immunoblot-Analyse, mRNA-Analyse, etc.) oder Mikroskopie (dh, konfokale oder Elektronenmikroskopie) geerntet werden. Die Kulturmedien kann auch für Cytokine oder LDH-Freisetzung für Zytotoxizitätsassays analysiert werden.

4. Repräsentative Ergebnisse

Erfolgreiche epithelialen Isolation, Proliferation und Differenzierung bei ALI sollte eine intakte Monolayer mit einem Pflasterstein-Morphologie zu erhalten. Transepithelilal Zellwiderstand von gesunden Kulturen sollten ca. 1000-2000 Ω / cm ² sein. Abbildung 2 zeigt eine Monoschicht von Maus respiratorischen Epithelzellen für Epithelzellen und Cilien Marker unter Kontrollbedingungen und nach Zigarettenrauch Exposition gefärbt. Abbildung 3 zeigt repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen von gesunden MTEC Kulturen darstellt Ultrastruktur und Zilien Morphologie.

Abbildung 1. Vorbereitung von Epithelzellen durchläuft drei Phasen, eine Isolierung Schritt, eine Ausbreitung der Bühne, und eine Differenzierung der Bühne an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (Schema). Epithelzellen sind von der Maus Luftröhre, auf Transwells, wo sie sich vermehren in Submerskultur ausgesät isoliert und dann in die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, wo sie in vollem Umfang zu differenzieren umgewandelt. Experimente sind in der Regel am ^24. Tag der kontinuierlichen Kultur durchgeführt. Das Bild zeigt ein Modell-System für die Belichtung von kultivierten Zellen zu Mainstream-Zigarette zu rauchen. Ein Transwell ALI Kultur ist innerhalb einer benutzerdefinierten modular Zigarettenrauch Lieferung System, das für Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO ₂ gesteuert wird gestellt.

Abbildung 2 Epitheliale Zellkulturen wurden fixiert und Zellkerne (Hoechst 33258), F-Aktin (grün; Alexa-Fluor-488-konjugierten Phalloidin). Und die Zilien Marker acetyliertes α-Tubulin (rot, Cy3-konjugierten sekundären Antikörper). Die unteren Bilder zeigen gleichwertige Bilder von Epithelzellen 4 Stunden nach der Exposition gegenüber Tabakrauch (2 Zigaretten, 150 mg / m ^3). (B) Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung wurde im Basalmedium 24 Stunden nach der Exposition gegenüber unterschiedlichen Dosen von Zigarettenrauch wie angegeben gemessen.

Abbildung 3. Air-Liquid-Interface Kulturen von Epithelzellen aus der Maus trachealen Epithel isoliert in mehrere Subtypen unterschieden, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) haben die Eigenschaften von Flimmerepithel, basal, und nicht Flimmerzellen ^1. Diese Zellen sind typisch pseudostratified respiratorischen Epithels. Abbildung Etiketten entsprechen: bb: Basaltemperatur, a: Axonem, m: Mitochondrien, n: Kern, s: Substrat (Polycarbonat-Membran), mv: microvili

Das Protokoll beschreibt Isolierung von Maus tracheale Epithelzellen aus den Protokollen der Sie et al angepasst., ^1, und andere ^2-3 mit Modifikationen. Wie bei jedem Protokoll beschreibt Zelle Isolationen, ist der wichtigste Aspekt, um eine Verunreinigung durch bakterielle oder pilzliche Erreger durch strikte aseptische Techniken zu vermeiden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, Fibroblasten-Kontamination der Kulturen, die durch sorgfältige Präparation der Luftröhre vermieden werden können, und negative Selektion, wie in Schritt 1.19 beschrieben zu vermeiden. Vorausgesetzt, dass die Kulturen überwacht werden, gewaschen und das Kulturmedium aufgefüllt jeden zweiten Tag nach der ersten 72 Stunden Inkubationszeit sollten die Kulturen vollständig in etwa zwei Wochen zu unterscheiden von der Einleitung des ALI.

Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), die weitgehend durch chronische Exposition Zigarettenrauch verursacht wird, weiterhin sind ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem ^4-7. COPD ist durch eine progressive Luftstrom Einschränkung zerstörerische alveolären Verlust (Emphysem) und übertriebene entzündliche Reaktionen der Lunge mit Zigarettenrauch ^4-7 aus. Eine große Anzahl von Studien haben alveoläre, Bronchien und Atemwege Epithelzelle Systeme verwendet werden, um zu modellieren Lungen-Zell-Reaktionen zu CS versucht. Viele dieser Studien in Epithelzellen oder transformierte Linien (dh Beas-2b) wurden durchgeführt, siehe Lit. ^8-11 für Beispiele. Die ALI Transwell Kultur-System ermöglicht die Kultur der pulmonalen Epithelzellen in der Mode, die näher an ihre physiologischen Orientierung in den Atemwegen, als das, was mit herkömmlichen flüssigen (unter Wasser) Kultur ^1-3 zur Verfügung gestellt werden kann. Obwohl die vorgestellten Protokoll beschreibt die Anwendung dieses Systems auf Maus tracheale primären Kulturen ^1, im Prinzip andere primäre Epithelzellen angewendet werden können (dh, Maus Typ II Epithelzellen, Human bronchialen Epithelzellen, etc.) sein. Die Anwendung von Live-Mainstream-CS auf Zellkulturen stellt ein Modell, das vielleicht mehr sehr nahe Exposition des Menschen gegenüber CS als Anwendung von wässrigen Zigarettenrauch Extrakt (CSE), die üblicherweise in zellulären Studien CS Exposition ^12-15 verwendet wird. CSE ist eine lösliche Anteil der Hauptstromrauch, dass viele chemische Bestandteile des gesamten Rauch fehlt. Während die beiden CS Exposition Systeme nur begrenzt aussagefähig sind, hat CSE den Vorteil, leichter kalibriert, da eine einzige Vorbereitung für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden können, und Dosierung ist durch Verdünnung ^15-16 erreicht. Auf der anderen Seite, sind wir hier ein Verfahren zur Quantifizierung Hauptstromrauch Übermittlung basierend auf TPM-Messungen. Die Aufklärung der molekularen und zellulären Reaktionen auf Toxinen ausgesetzt, insbesondere CS wie in diesem Artikel veranschaulicht, wird weiter das Verständnis der Auswirkungen der Luftverschmutzung auf die menschliche Gesundheit, insbesondere der Entstehung von chronischen Erkrankungen der Lunge.