L'isolement de la souris les cellules épithéliales respiratoires et l'exposition à la fumée de cigarette expérimentale chez Air interface liquide

Le protocole global nécessite 2 jours pour des isolations de cellules d'un tissu animal, 5-10 jours pour la prolifération cellulaire, et une de 10 à 14 jours supplémentaires pour la différenciation cellulaire à l'interface air-liquide. Une journée supplémentaire est nécessaire pour les expositions de cellules et de récolte des échantillons.

1. Isolement des souris trachéobronchique cellules épithéliales (MTEC).

Note: Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinés et approuvés par les soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisez au Brigham and Women 's Hospital / Harvard Medical School Area.

Avant de commencer:

• Préparer F12 de Ham médias contenant des antibiotiques. Pour 250 ml de Ham F12 milieux de base (Cellgro) ajouter 2,50 ml d'une pénicilline 100 X / streptomycine (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) solution et 250 ul d'une solution X 1000 Fungizone. Conserver à 4 ° C pendant 4 semaines au maximum.
• Préparer une solution de pronase 0,15%. Ajouter 15 mg pronase à 10 mL de Ham F12 médias contenant des antibiotiques. Faire frais et les garder sur la glace jusqu'à utilisation.
• Préparer une surface de travail propre et stérile des instruments chirurgicaux appropriés pour la chirurgie des petits animaux, et d'une hotte tissu lamellaire culture pour isolement cellulaire. Tous les autres équipements est considéré comme standard pour la culture de cellules animales, y compris humidifié CO ₂ incubateurs, chambre froide, cellule de table centrifugeuses, microscope inversé, et jetables de pipette en plastique et ustensiles de la culture.
• Préparer une solution de collagène I (50 pg / mL dans 0,02 N d'acide acétique). Pipeter 1,0 ml solution de collagène dans chaque puits d'une plaque de 12 puits transwell (Corning). Envelopper dans du parafilm et laisser reposer une nuit sur une surface plane à la température ambiante.

1. En utilisant une souche de souris disponibles dans le commerce (c'est à dire, C57BL / 6, mâle 6-8 semaines), euthanasier des souris en utilisant une méthode approuvée de l'euthanasie comme le CO ₂ induit une narcose. Typiquement 6 souris donnera suffisamment de cellules (1,5-2,0 x 10 ⁵ cellules / souris) aux semences d'une plaque de 12 puits transwell.
2. Vaporiser les carcasses des animaux avec une solution EtOH à 70% pour stériliser le terrain.
3. Avec propres ciseaux chirurgicaux et de scalpel, enlever la peau autour de la zone trachéale, et d'exposer la trachée. Ouvrez l'abdomen, couper le long du sternum, et enlever la cage thoracique. Retirez le tissu jusqu'à la fin de la trachée est exposée.
4. Trachées Placer dans un tube conique de 50 ml contenant 30 ml de Ham F12 supports contenant des antibiotiques, sur la glace.
5. Dans une hotte à flux lamellaire stérile, le transfert de tissu trachéal dans un plat stériles 100 mm de Pétri contenant 10 ml de Ham F12 supports contenant des antibiotiques.
6. Doucement disséquer le tissu conjonctif avec des pinces stériles et des ciseaux chirurgicaux.
7. Transfert tissu trachéal à un nouveau plat de 100 mm de Pétri contenant 10 ml de Ham F12 supports contenant des antibiotiques pour se rincer. Couper le long des trachées axe vertical à exposer lumen.
8. Transfert trachées d'un tube de 50 ml contenant 10 ml de solution pronase 0,15% et incuber une nuit à 4 ° C.
9. Le deuxième jour, avoir en main:
   • Préparer une solution de DNase I. À 18 ml de F12 de Ham médias contenant des antibiotiques ajouter 2 mL de 10 mg / ml solution de sérum bovin stock de l'albumine (BSA), et 10 mg de brut du pancréas DNAse I. Faire aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C (décongelées sur la glace avant utilisation).
   • Préparer F12 de Ham support contenant des antibiotiques avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS). Pour 200 ml de Ham F12 milieux de base (Invitrogen) ajouter 50 ml de FBS inactivé de la chaleur, 2,5 mL d'une pénicilline 100 X / streptomycine (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) solution, et 250 ul d'une solution X 1000 Fungizone .
   • Préparer MTEC milieu de base contenant des antibiotiques. Pour 475,5 mL DMEM/F12 multimédia de base (Cellgro) ajouter 7,5 mL 1 M HEPES solution, 10 ml de solution de 200 mM de glutamine, 2 ml d'un 7,5% NaHCO _3, 5 mL d'une pénicilline 100 X / solution de streptomycine, 500 ul d'une solution X 1000 Fungizone
   • Préparer FBS MTEC% medium/10. Pour 45 ml d'MTEC milieu basique contenant des antibiotiques, ajoutez 5 ml de FBS inactivé de la chaleur.
10. Secouez doucement le tube (de l'étape 1.8) 10-12 fois, puis laissez-le reposer pendant 30-60 minutes à 4 ° C.
11. Ajouter 10 ml de Ham F12 supports contenant 20% de FBS et des antibiotiques pour le tube et le rock 12 fois.
12. Préparer 3 tubes coniques 15 ml contenant 10 ml de Ham F12 supports contenant 20% de FBS et des antibiotiques.
13. Retirer trachées de la solution pronase, mettant de côté cette solution sur la glace. Transfert trachées au tube conique première contenant F12 de Ham et inverser le tube 12 fois. Répétez ce processus deux fois plus.
14. Combinez solution de pronase avec les trois surnageants de l'étape 1.13 en un seul tube de 50 ml. Jeter les tissus restants.
15. Centrifuger à 1400tr/min (390 xg; Eppendorf 5810R centrifugeuse équipée d'un rotor A-4-62) pendant 10 min à 4 ° C, et éliminer le surnageant.
16. Doucement Reprendre le culot dans 1 ml de solution de DNAse (100-200 ul / trachée)et incuber 5 min sur la glace.
17. Centrifuger à 1400tr/min (390 xg) pendant 5 min à 4 ° C, et éliminer le surnageant.
18. Reprendre le culot cellulaire dans 8 ml MTEC milieu contenant 10% de FBS
19. Suspension cellulaire plaque sur plaques Primaria (Falcon). Incuber à 37 ° C dans une atmosphère d'air de 95%, 5% de CO ₂ pendant 5 heures (Note: ceci est une étape de sélection négative pour les fibroblastes).
20. Recueillir la suspension cellulaire à partir de plaques et rincer les plaques à deux reprises avec 4 ml MTEC contenant 10% de FBS. Suspension cellulaire piscine et les lave-ensemble dans un tube conique de 50 ml.
21. Conserver 1 mL pour cytospin et le comptage des cellules. De spin dans une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Retirer 500 pl et resuspendre le culot dans le surnageant restant. Utiliser 100 uL pour le comptage des cellules en utilisant la méthode coloration au bleu trypan vitale. Conserver 4 aliquots de 100 ul d'analyse cytospin
22. Spin reste, soit 15 ml de suspension cellulaire à 1400tr/min (390 xg), à 4 ° C pendant 10 min.

2. Multiplication et différenciation des MTEC Au interface air-liquide

Préparer rétinoïque solutions stock d'acide. Une solution stock: Peser l'acide rétinoïque dans le noir (M. 300,44 g / mol) pour faire une solution à 5 mM dans EtOH 95%. Conserver dans un tube de papier d'emballage à -80 ° C. Au besoin, préparer la solution stock B (5 uM) en ajoutant 50 uL Stock A, 500 uL solution de BSA (100 mg / ml) et 49,5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Stocker dans une feuille enroulée du tube à -80 ° C pendant 4 semaines au maximum.

Préparer milieu de prolifération MTEC contenant l'acide rétinoïque. Pour 45,7 mL médias MTEC basale contenant des antibiotiques, ajouter inactivés par la chaleur de 2,5 mL de FBS, 1 ml d'acide rétinoïque Stock B, 250 uL solution d'insuline (2 mg / mL d'insuline dans 4 mM HCl), 250 uL solution de facteur de croissance épidermique (5 pg / ml EGF dans HBS contenant 1 mg / ml de BSA), 200 ul d'extrait pituitaire bovin (15 mg / mL dans HBS contenant 1 mg / ml de BSA), une solution à 50 uL de la transferrine (5 mg / ml de transferrine dans HBS contenant 1 mg / ml de BSA ), solution à 50 uL toxine cholérique (100 mg / mL dans HBS contenant 1 mg / ml BSA). Stériliser par filtration finale la préparation des milieux et l'utilisation dans les 2 jours de préparation.

1. Retirer solution de collagène à partir de plaques transwell, laisser reposer sous le capot pendant 5 min, et laver avec du PBS deux fois.
2. Après la centrifugation, resuspendre le culot cellulaire dans un volume approprié de la prolifération des médias (500 pl) pour faciliter le placage de 7,5 x 10 ⁴ -1,0 x10 ⁵ cellules par puits. Pipeter 500 uL suspension cellulaire sur la surface apicale de l'insert transwell membrane en polycarbonate. Ajouter 1,5 mL de la prolifération des médias dans le compartiment basal de la transwell.
3. Incuber les cultures MTEC submergée à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 95% d'air, 5% de CO ₂ pour les 7-10 jours.
4. Attendre trois jours avant de changer de média pour la première fois. Changer les médias tous les jours. Surveiller les cultures par une inspection visuelle et la mesure de résistance de la cellule en utilisant une électrode transépithélial (EVOM Ohmvoltometer, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride).
5. Lorsque les cellules confluentes apparaissent et la résistance épithéliale atteint 1000 Ω / cm ^2, les cellules sont prêtes à se différencier à Ali.
6. Préparer MTEC milieux de base contenant NuSerum 2%. Ajouter au NuSerum MTEC milieu basique à une concentration finale de 2% V / V. Ajouter rétinoïque B Stock acide à une concentration finale de 1 x 10 ^-7 M avant d'utiliser. Préparer une solution fraîche et utiliser dans les 2 jours.
7. Laissez la cellule de différencier pendant 10-14 jours, en supprimant les médias apicale et le remplacement des milieux de base avec 750 uL MTEC milieux de base contenant 2% d'acide rétinoïque et Nuserum. Changer les médias basale et laver le côté apical avec MTEC contenant NuSerum 2% tous les autres jours.

3. Application de fumée de cigarette à des cultures de cellules épithéliales

1. Exposer la partie apicale des cultures transwell à la fumée de cigarette dominante en utilisant un système d'exposition au CS cellule (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Voir la Figure 1 pour une photographie de l'appareil. Voir le tableau des réactifs et équipements spécifiques pour les spécifications techniques. En bref, l'appareil est constitué d'une pompe péristaltique qui fume chaque cigarette en ~ 7-8 bouffées, dessin dans la fumée principale dans une ligne de polypropylène qui est relié à une chambre d'exposition ventilé. La chambre d'exposition est maintenue à 37 ° C par circulation d'eau, et maintenue à une atmosphère de 5% de CO ₂ sur une ligne de gaz. Les cellules peuvent être exposés à la fumée à l'aide du Kentucky 3R4F de recherche de référence cigarettes à bout filtre (Le tabac Research Institute, Université du Kentucky, Lexington, KY). Généralement les cellules sont exposées à la fumée de 1 à 2 cigarettes, ce qui donne 100-200 mg / m ³ de matières particulaires totales (MPT). Contrôle des cultures sont exposées à l'air ambiant pendant une période d'exposition équivalente.
2. Le TPM est mesurée selon le protocole du fabricant fournies avec le TE-10c machine à fumer (Entreprises Teague). En bref, un filtre (Pallflex) est placé dans un support en acier inoxydable en ligne sur un tuyau de prélèvement débouchant à partir du port d'échantillonnage sur la chambre de fumage à une pompe à débit constant (unité d'échantillonnage). Un tube de sortie se connecte l'unité d'échantillonnage à un compteur de gaz (compteur de gaz sec, ONM61, 67, AEM). Le filtre est pesé avant et après le prélèvement du gaz. Le matériel total déposé sur le filtre en mg est normalisée pour le volume total d'air échantillonné.
3. Les cellules peuvent ensuite être récoltées à n'importe quel point dans le temps (ie, 0-24 heures) après l'exposition pour les procédures analytiques standard cellulaire (c'est à dire, Western immunoblot, analyse d'ARNm, etc) ou la microscopie (ie, la microscopie confocale ou électronique). Les milieux de culture peuvent également être analysés pour des cytokines ou la libération de LDH pour les tests de cytotoxicité.

4. Les résultats représentatifs

Le succès d'isolement épithéliales, la prolifération et la différenciation à ALI devrait donner une monocouche intacte avec une morphologie pavées. Résistance de la cellule Transepithelilal des cultures saines devrait être d'environ 1000-2000 Ω / cm ^2. La figure 2 illustre une monocouche de cellules épithéliales respiratoires de souris colorées pour cellules épithéliales et les cils marqueurs dans des conditions de contrôle et après l'exposition de fumée de cigarettes. La figure 3 montre microscope électronique représentant de saines cultures MTEC, dépeignant ultrastructure et la morphologie des cils.

Figure 1. Préparation du produit de cellules épithéliales par trois phases, une étape d'isolement, une étape de propagation, et un stade de différenciation à l'interface air-liquide (schéma). Les cellules épithéliales sont isolées de la souris trachée, ensemencées sur transwells où elles prolifèrent en culture immergée, puis convertie en interface air-liquide où ils totalement différencier. Les expériences sont généralement menées sur le 24 ^e jour de culture continue. L'image représente un système modèle pour l'exposition de cellules cultivées à la fumée de cigarette traditionnelle. Un système de culture transwell ALI est placé à l'intérieur d'un système personnalisé de cigarettes fumées modulaire de livraison qui est contrôlée par la température, l'humidité et de CO _2.

Figure 2 cultures de cellules épithéliales ont été fixées et colorées pour les noyaux (Hoechst 33258), F-actine (vert; Alexa Fluor-488-phalloïdine conjuguée). Et le marqueur de cils acétylés α-tubuline (en rouge; Cy3 anticorps secondaire conjugué). Les panneaux inférieurs montrent des images équivalentes des cellules épithéliales pris 4 heures après l'exposition à la fumée de cigarette (2 cigarettes, 150 mg / m ^3). (B) lactate déshydrogénase (LDH) libération a été mesurée dans le milieu de base 24 heures après l'exposition à des doses variables de la fumée de cigarette, comme indiqué.

Figure 3. Cultures interface air-liquide des cellules épithéliales isolées de l'épithélium trachéal de souris différencier dans plusieurs sous-types que par microscopie électronique à transmission (MET) ont les caractéristiques d'ciliées, des cellules basales, et non ciliées ^1. Ces cellules sont typiques pseudo-épithélium respiratoire. Figure étiquettes correspondent à: bb: basale du corps, un: axonème, m: mitochondries, n: le noyau, s: substrat (membrane en polycarbonate), mv: microvili

Le protocole décrit l'isolement de la souris des cellules épithéliales trachéales est adaptée à partir des protocoles de You et coll., ^1, et d'autres ^2-3 avec des modifications. Comme avec n'importe quelle cellule isolements protocole décrivant l'aspect le plus essentiel est d'éviter la contamination par des pathogènes bactériens ou fongiques en utilisant des techniques aseptiques strictes. Une seconde étape essentielle est d'éviter la contamination des cultures de fibroblastes, qui peuvent être évitées par une dissection minutieuse des trachées, et la sélection négative telle que décrite à l'étape 1.19. Pourvu que les cultures sont contrôlées, lavées et le milieu de culture reconstitué tous les jours après la première incubation de 72 heures, les cultures devraient pleinement différencier dans environ deux semaines de l'ouverture de l'ILA.

Maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), qui est largement causée par la fumée de cigarette d'exposition chronique, continue à représenter un problème majeur de santé mondiale ^4-7. BPCO est caractérisée par l'obstruction bronchique perte progressive et destructrice alvéolaires (emphysème), et exagérée des réactions inflammatoires des poumons à ^4-7 fumée de cigarette. Un grand nombre d'études ont utilisé des alvéoles, des bronches, et des systèmes de cellules épithéliales des voies aériennes pour tenter de réponses modèle de poumon de cellules à CS. Beaucoup de ces études ont été menées dans la cellule épithéliale ou lignées transformées (c'est à dire, BEAS-2B), voir réf ^8-11 pour des exemples. Le système de culture ALI transwell permet la culture de cellules épithéliales pulmonaires à la mode qui est plus proche de leur orientation physiologique dans les voies respiratoires, que ce qui peut être fournie par un liquide conventionnel (immergée) de la culture ^1-3. Bien que le protocole en vedette décrit l'application de ce système à la souris trachéale cultures primaires ^1, en ​​principe d'autres cellules épithéliales primaires peuvent être appliqués (par exemple, souris Type de cellules épithéliales II, cellules épithéliales bronchiques humaines, etc.) L'application du courant direct CS pour les cultures de cellules représente un modèle qui peut-être plus se rapproche l'exposition humaine à CS que l'application de l'extrait de la fumée de cigarette aqueuse (CST), qui est couramment utilisé dans les études cellulaires de l'exposition CS ^12-15. CST représente une fraction soluble de la fumée principale qui manque de nombreux composants chimiques de la fumée de l'ensemble. Bien que les deux systèmes ont leurs limites d'exposition CS, le CST a l'avantage d'être plus facilement calibré, car une seule préparation peut être utilisée pour des expériences multiples, et le dosage est réalisé par dilution ^15-16. D'autre part, nous incluons ici une méthode pour quantifier la fumée principale de livraison basé sur des mesures TPM. L'élucidation des réponses moléculaires et cellulaires à l'exposition aux toxines, en particulier CS comme illustré dans cet article, permettra de mieux comprendre l'impact de la pollution atmosphérique sur la santé humaine, en particulier l'étiologie des maladies chroniques du poumon.