चूहे में कोरोनरी धमनी आड़ के लिए एक हैंगिंग वजन सिस्टम का प्रयोग

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जनरल टिप्पणी:

सभी आपरेशनों एक ईमानदार विदारक माइक्रोस्कोप (ओलिंप, SZX10 Z-अक्ष STU2 StandBoom स्टैंड के साथ क्रैंक पोस्ट के साथ) के तहत किया जाना चाहिए और एक शल्य चिकित्सा coagulator का उपयोग. वेंटिलेशन प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है और इसलिए समय की एक निश्चित राशि वेंटीलेटर चुनने और वेंटिलेशन तकनीक के अनुकूलन पर खर्च किया जाना चाहिए. तापमान, रक्तचाप और संज्ञाहरण भर में स्थिर होना चाहिए.

1. संज्ञाहरण इंटुबैषेण, और निगरानी

1. C57BL / 6 चूहों कि कम से कम 10 सप्ताह पुराने हैं का उपयोग करें. एक खुराक शरीर 70 मिलीग्राम / किग्रा वजन आईपी पर pentobarbital सोडियम का उपयोग कर प्रेरित संज्ञाहरण लगभग 10 मिलीग्राम किग्रा / / ज सोडियम pentobarbital के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें. Overdosing के बाद से इस महत्वपूर्ण रक्तचाप कम हो सकता है के साथ सावधान रहो. Pentobarbital की पुनः dosing के बाद भी प्लाज्मा स्तर में गंभीर वृद्धि करने के लिए नेतृत्व बजे कर सकते हैं. मजबूत cardioprotective यौगिक के रूप में isoflurane के बारे में सबूत के आधार पर हम 'निष्क्रिय' और अच्छी तरह से myocardial ischemia ^46-56 के लिए एक मॉडल में pentobarbital स्थापित का उपयोग की सलाह देते हैं.
2. एक गुदा थर्मामीटर थर्मल प्रतिक्रिया नियंत्रक से जुड़ी जांच के लिए 37 पर शरीर का तापमान बनाए रखने के साथ एक तापमान नियंत्रित गरम (आरटी, Effenberg, म्यूनिख, जर्मनी) तालिका डिग्री सेल्सियस पर प्लेस चूहों
3. संज्ञाहरण ऊपरी और निचले extremities के साथ एक टेप और टखनों को fastened सीवन का उपयोग कर कोई तालिका से जुड़ी एक लापरवाह स्थिति में प्रेरण सुरक्षित चूहों के बाद. दांत का उपयोग करके सिर के लिए एक ही मत करो. पर्याप्त निरोधक एक सफल इंटुबैषेण और अच्छी तरह से नियंत्रित सर्जरी के लिए महत्वपूर्ण है. पहले सर्जरी के लिए, खनिज तेल के साथ माउस को कवर करने के लिए माउस बाल एलर्जी के जोखिम को कम.
4. ट्रेकिआ शल्य चिकित्सा बेनकाब और एक tracheal bluntpolyethylene cannulae (Insyte 22g, Beckton Dickinson, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग इंटुबैषेण प्रदर्शन. आप सुई कुंद करने के लिए यह एक कटार के रूप में उपयोग करने में सक्षम हो जाएगा.
5. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर बाहर जीभ खींचो और फिर शरीर की दिशा में एक 15 डिग्री के कोण में धीरे से धक्का. ट्रेकिआ के प्रदर्शन के बाद भी और एक खुर्दबीन का उपयोग कर, यह कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है. पता है कि ट्रेकिआ के एक छोटे से नुकसान सीवन भर पशु हवादार अक्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस प्रकार, यदि आप मुठभेड़ airway समस्याओं छोटे छेद के लिए ट्रेकिआ की जाँच करें.
6. प्रवेशनी के प्रत्यक्ष दृश्य के द्वारा Carina ऊपर पहले से उजागर ट्रेकिआ के भीतर सही ट्यूब नियुक्ति की पुष्टि करें.
7. एक वेंटीलेटर ट्यूब कनेक्ट. हम सीमेंस (DRE पशु चिकित्सा, संयुक्त राज्य अमरीका) से एक सर्वो 900 सी का उपयोग करके एक दबाव नियंत्रित वेंटिलेशन तकनीक की सलाह देते हैं. पशु तो एक ₂ 0.4 = FiO के साथ 110 साँस / मिनट 10 mbar आवृत्ति, और mbar 3-5 की एक सकारात्मक expiratory अंत दबाव के चोटी inspiratory दबाव का उपयोग करने के लिए हवादार जाएगा. सेटिंग्स कि खुले छाती सर्जरी के दौरान फेफड़ों की जाँच द्वारा सबसे आसानी से हासिल कर सकते हैं कुछ समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. यकीन है कि फेफड़ों ढह या overextended नहीं हैं. तथ्य यह है कि सर्वो 900 सी मानव के लिए वेंटीलेटर के रूप में बनाया गया है के बावजूद, एक दबाव नियंत्रित वेंटीलेटर सेटिंग में इसके उपयोग के चूहों की सुनवाई के लिए उत्कृष्ट काम करता है.
8. रक्त गैस विश्लेषण करने के लिए मैं - स्टेट का उपयोग वेंटिलेशन समय के 4 से 6 घंटे के बाद सामान्य गैस एक्सचेंज (ऑक्सीजन की आंशिक दबाव, 115 के ₂ पाओ ± ± 15 mmHg और कार्बन डाइऑक्साइड, 38 के ₂ Paco के आंशिक दबाव 6 mmHg) की पुष्टि प्रणाली (Abbott, संयुक्त राज्य अमरीका).
9. एक ईसीजी (उदाहरण के लिए हेवलेट पैकार्ड, Böblingen, जर्मनी) के साथ मॉनिटर दिल की दर. यकीन है कि हृदय की दर को 450 के नीचे छोड़ नहीं करता है है. यदि माउस विकसित bradicardia तापमान और चतनाशून्य करनेवाली औषधि खुराक / एकाग्रता की जांच. Xylacin / Ketamin संज्ञाहरण 250 / मिनट की एक दिल दिल लाती है और इसलिए की सिफारिश नहीं है.
10. एक उचित तरल प्रतिस्थापन लागू. के साथ एक जलसेक सामान्य खारा 0.1 मिलीलीटर / एक धमनी या शिरापरक कैथेटर के माध्यम घंटे ischemia की शुरुआत से पहले किया जाना चाहिए. इसके अलावा, 500 μl की एक नमकीन सांस में सर्जरी के लिए पहले आईपी दिया जा सकता है. Thoractomy रक्तचाप में एक बूंद पैदा कर सकते हैं और अतिरिक्त खारा बोली की आवश्यकता हो सकती है. Ischemia के बाद, एक जलसेक 1 मिलीग्राम / घंटा दर एक मतलब 60 mmHg ऊपर धमनी रक्तचाप को बनाए रखने और पर्याप्त रोधगलितांश टीटीसी का उपयोग धुंधला के लिए महत्वपूर्ण reperfusion की गारंटी करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
11. रक्तचाप की सतत रिकॉर्डिंग के लिए एक मन्या धमनी (PE10, युक्ति (mm / आयुध डिपो "), पतला> mm/.011 .024") रखें. मन्या धमनी paratracheal मांसपेशियों की कुंद विच्छेदन के माध्यम से उजागर किया जाएगा. और अधिक जोखिम और किसी भी ऊतक आघात (vagal तंत्रिका के विशेष) सावधान परिहार के बाद, एक कैथेटर दो sutures और एक छोटे से दबाना का उपयोग पोत में डाला जाता है. शरीर को हाथ संलग्न पहले कि आप धमनी विदारक शुरू. यह धमनी की एक लंबा टुकड़ा का खुलासा होगा. गाँठ मन्या धमनी की प्रॉक्सिमल भाग के बहुत अंत. के लिए एक बड़ा दबाना करने के लिए सीवन के अंत में संलग्नतनाव प्राप्त. धमनी के आसपास एक और सिवनी प्लेस और बहुत बाहर का अंत करने के लिए धमनी काटना. यहाँ, एक छोटे से दबाना जगह है. सूक्ष्म कैंची का उपयोग करने के लिए धमनी में एक छोटे विकर्ण खोलने में कटौती. एक ठीक संदंश (Dumont, डब्ल्यूपीआई) के साथ खोलने पकड़ो और अपने हाथों / संदंश के साथ उचित आकार कैथेटर अग्रिम. अपने दूसरे सीवन के साथ एक गाँठ और धमनी सुरक्षित. क्लैंप ढीला और कैथेटर आगे अग्रिम. कई समुद्री मील और टेप के साथ कैथेटर सुरक्षित.

2. कोरोनरी धमनी आड़ की तकनीक

1. त्वचा काटना और बाईं छाती दीवार एक कुंद विच्छेदन तकनीक का उपयोग कर बेनकाब.
2. मांसपेशियों pectorals बड़ी कंपनियों और नाबालिगों कट दाग़ना के साथ छाती की दीवार का पर्दाफाश. Pectoralis प्रमुख खींच करके, फेफड़ों बूँदें, जिससे electrosurgical इकाई से एक संदंश, डाला जा सकता है, और फेफड़ों के ऊपर 1-3 मिमी, एक क्षैतिज रेखा पार rips coagulated होना चाहिए.
3. पा कैंची का उपयोग करके, छाती दीवार काटा. संशोधित सेफ्टीपिन, जहां पकड़ प्लेट हटा दिया है और कुंद अंत तुला हुआ है तो छाती को खुला रखने के लिए किया जाता है.
4. सीवन के अंतिम प्लेसमेंट की सुविधा के लिए, जमना, और छाती के निचले बाईं ओर की दिशा में डायाफ्राम के साथ छाती दीवार में कटौती.
5. Pericardium विदारक दिल बेनकाब. Diaphragmatic आंदोलनों से बचने के लिए निकालने और phrenic तंत्रिका कटौती.
6. एक संदंश के साथ एक छोटे से गीला कपास छड़ी का प्रयोग करें और सही पक्ष की ओर दिल की बारी है. बाईं कोरोनरी धमनी (एलसीए) को पहचानें और यकीन है कि फेफड़े भी नहीं फुलाया जाता है. छाती के उद्घाटन का अनुकूलन के लिए दिल के एक सुरक्षित पकड़ है जब सीवन रखने के लिए. यदि रक्तचाप बहुत कम है पहचान जटिल हो सकता है. खारा के अतिरिक्त बोलि एलसीए की पहचान में सुधार हो सकता है. एलसीए एक चमकदार लाल दिल क्षैतिज पार (लौट नसों के विपरीत) पोत है. कभी कभी, एलसीए एक खुर्दबीन के बिना सबसे अच्छा में देखा जाता है. बहुत ज्यादा प्रकाश का उपयोग न करें. यह दृश्य असंभव बनाने प्रतिबिंब तोड़ नेतृत्व कर सकते हैं.
7. एक बार एलसीए नेत्रहीन की पहचान की है, एलसीए के चारों ओर एक 8.0 नायलॉन सिवनी (Prolene, Ethicon, Notiefies, संयुक्त राज्य अमेरिका) जगह है. आंतरायिक एलसीए रोड़ा के प्रयोजन के लिए, हम फांसी वजन प्रणाली का उपयोग कर ⁴² कार्डियोमायोपैथी की एक पुरानी मॉडल को अपनाया.
8. प्लास्टिक की ट्यूब के एक छोटे से कुंद किनारों के साथ (टयूबिंग पीई 10) टुकड़ा के माध्यम से सिवनी धागा और प्रत्येक के अंत करने के लिए दो छोटे वजन (1g, जैसे उपयोग Eppendorf पानी से भरा ट्यूबों) देते हैं. स्वतंत्र रूप से एक छड़ी पर लटका वजन के साथ, एलसीए occluded तुरंत किया जाना चाहिए. इसके अलावा, जब वजन राहत मिली है, एलसीए रोड़ा एक ही बार में समाप्त होता है. सफल एलसीए रोड़ा अंधेरे बैंगनी, मायोकार्डियम का रंग चमकदार लाल से सफेद करने के लिए पोत और ईसीजी में अनुसूचित जनजाति के उन्नयन के उपस्थिति द्वारा आपूर्ति के परिवर्तन के लिए लाल बत्ती से पोत का एक तत्काल रंग बदलने के द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए. Reperfusion के दौरान, रंग के परिवर्तन तुरन्त गायब. दिल एक 37 डिग्री सेल्सियस, खारा शोषक कपास की लथपथ टुकड़ा भर (यह भी देख चित्रा 1) के साथ गीला रखें.
9. अपनी प्राथमिक हित के अनुसार अपने ischemia समय चुना. वास्तव में, आईपी के cardioprotective प्रभाव के अध्ययन के लिए, यह एक एएआर के लगभग 30 से 40% के रोधगलितांश आकार में एक के साथ जुड़े ischemia समय का उपयोग करने के लिए आदर्श होगा. इस प्रकार, यह संभव हो सकता है दोनों दिशाओं में परिवर्तन, हृदय आईपी या एक प्रयोगात्मक चिकित्सकीय या एक विशिष्ट जीन विलोपन के साथ बड़ा रोधगलितांश आकार के साथ जैसे छोटे रोधगलितांश आकार का प्रदर्शन होगा. इसके अलावा, कम से कम 50% की एक रोधगलितांश आकार के साथ चूहों आमतौर पर प्रयोग जीवित है, जबकि 60 से 80% के रोधगलितांश आकार अक्सर बच कर रहे हैं पशुओं मर जाते हैं reperfusion की समय से पहले पूरा हो गया है और नहीं. हमारे मॉडल myocardial ischemia के 10 मिनट 3.5 के एक रोधगलितांश आकार में reperfusion परिणाम के 2 घंटे के द्वारा पीछा किया ± आर के 1.3% का उपयोग करना. इसके विपरीत में, 42 के एक मतलब रोधगलितांश आकार में 60 मिनट के परिणामों के एक ischemia समय ± एएआर (पी ^0.01 <) 39 के 5.2 %. इस प्रकार, हम आदर्श के रूप में एक 60 मिनट ischemia के दोनों दिशाओं में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए पर विचार करें. फिर भी, आप लक्षित जीन चूहों में एक तोड़ phenotype के साथ ischemia समय समायोजित हो सकता है.
10. सही reperfusion की समय चुना. reperfusion की समय टीटीसी धुंधला के लिए महत्वपूर्ण है. बेरंग डाई सह एंजाइम NADH की उपस्थिति में dehydrogenases द्वारा ईंट लाल रंग का वेग कम है. मर कोशिकाओं उनके NADH और इसलिए, लाल दाग व्यवहार्य मायोकार्डियम के भीतर पीला क्षेत्रों के रूप में चित्रित कर रहे हैं बनाए रखने की क्षमता खो देते हैं. Infarct टीटीसी द्वारा आकार चित्रण की आवश्यकता है कि NADH बाहर धोया गया है परिगलित क्षेत्र से पूरी तरह. हालांकि, अगर reperfusion की लंबे समय पर्याप्त नहीं है, टीटीसी धुंधला रोधगलितांश आकार चित्रण वास्तविक रोधगलितांश ⁴³ आकार के एक मूल्यवान समझना में परिणाम कर सकते हैं. हमारे हाथों में, 60 मिनट की एक ischemia समय के बाद, रोधगलितांश आकार माप 11.5 से बढ़ ± 42,2 करने के लिए 30 मिनट के बाद 4.5% ± 5.1%120 मिनट के बाद. रोधगलितांश आकार में आगे कोई वृद्धि ³⁹ अब reperfusion बार (240 मिनट) के साथ पता लगाया जा सकता है . इस प्रकार, हम 2 घंटे reperfusion की अवधि जो भी हृदय एंजाइम determination.If आप ischemia शर्त पर विचार के संदर्भ में उचित लगता है की सलाह देते हैं, हम आईपी 4 चक्र (5 मिनट ischemia, 5 मिनट reperfusion) की सिफारिश, 60 के एक ischemia समय से पीछा मिनट और 2 घंटे के एक reperfusion की समय. इन शर्तों के तहत, आईपी 42.2 से 3.2 गुना रोधगलितांश आकार की कमी ± 5.1% 13.3 ± ³⁹ एएआर के 3.3% के साथ जुड़े थे . हालांकि, फांसी वजन प्रणाली के कारण, अलग शर्त रेजिमेंटों को आसानी से लागू किया जा सकता है.

3. जोखिम में क्षेत्र के निर्धारण (आर) और myocardial infarct आकार

एक myocardial infarct (आईपी के साथ या बिना) की प्रेरण के बाद क्षेत्र में एलसीए (खतरे में क्षेत्र, आर) और रोधगलितांश के आकार के ही एक धुंधला तकनीक का उपयोग निर्धारित किया जाएगा द्वारा perfused है. इसके बाद, रोधगलितांश तो एएआर के लिए तुलना में रोधगलन के प्रतिशत के रूप में गणना की जा. ऐसा करने के लिए, एक पहले से वर्णित इवान नीले और triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ ^डबल धुंधला तकनीक 44 उपयोग किया जाता है.

1. % 1 इवान महाधमनी में नीले रंग की डाई के इंजेक्शन प्रतिगामी द्वारा एएआर निर्धारण जबकि एलसीए occluded है. वैकल्पिक रूप से, अगर एक carotis कैथेटर जगह में है, इवांस नीले इंजेक्शन के लिए इस मार्ग का उपयोग करें. इवांस नीले एएआर छोड़कर सभी दौरे ऊतक नीले दाग होगा. यह कैथेटर के भीतर हवाई बुलबुले से बचने के इस कदम के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में वे कोरोनरी संचलन में इंजेक्शन होगा और इवान रोकने के नीले रंग धुंधला हो जाना है. पहले इवांस नीले रंग धुंधला हो जाना करने के लिए आप हृदय एंजाइम माप के लिए खून लेने के लिए चाहते हो सकता है. इसके अलावा, रक्त की एक महाधमनी या carotis कैथेटर के माध्यम से खारा के 5 मिलीलीटर का इंजेक्शन लगाने के द्वारा हटाने की सिफारिश की है.
2. उत्पाद शुल्क और बर्फ के ठंडे 0.9% खारा में दिल धो
3. 2% agarose में एम्बेड. मत गर्म agarose इस्तेमाल के बाद से यह सफल धुंधला रोकने जाएगा.
4. में 4 पर 30 मिनट के बाद ° सी (या 15 मिनट -20 ° सी), 1 मिमी की एक दिल मैट्रिक्स या सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग स्लाइस में दिल काटा. यदि आप फ्रीजर में दिल की जगह शुष्क ठंड से बचने के जो गैर दाग दिल के लिए नेतृत्व करेंगे.
5. 1% टीटीसी के साथ 37 स्लाइस सेते ° सी एक पानी के स्नान में 10 मिनट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर नीली टोपी के लिए. यह एक सफेद क्षेत्र के रूप में infarcted क्षेत्र सीमांकन करने के लिए अनुमति देते हैं, जबकि व्यवहार्य ऊतक दाग लाल.
6. रात 10 से अधिक% fomaldehyde के साथ दाग स्लाइस fixate. ऐसा करके, infarcted क्षेत्र बेहतर चित्रों की गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए विपरीत है.
7. खतरे में क्षेत्र (एएआर) और planimetry NIH सॉफ्टवेयर छवि ⁴⁵ 1.0 का उपयोग कर के माध्यम से रोधगलितांश आकार का निर्धारण करते हैं.
8. खतरे में क्षेत्र से infarcted मायोकार्डियम के प्रतिशत की गणना.

4. कार्डिएक एनजाइम मापन

टीटीसी धुंधला के साथ जुड़े सीमाओं के कारण हम दौरे रोधगलितांश गंभीरता हृदय troponin (cTnI) मैं चूहों के सीरम में स्तर के निर्धारण के लिए के रूप में अतिरिक्त readout सलाह देते हैं. रक्त पोर्टल शिरा और सीरम cTnI स्तर से प्राप्त हो जाएगा रहे हैं तो एक मात्रात्मक तेजी cTnI परख (जीवन निदान, Inc, पश्चिम Chester, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, संयुक्त राज्य अमरीका) के साथ निर्धारित है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1 (ए) हृदय आईपी मॉडल फांसी वजन कोरोनरी रोड़ा के एक प्रणाली का उपयोग . इस तकनीक को कोरोनरी रोड़ा के लिए एक गाँठ की आवश्यकता नहीं है. (बी, सी) सर्जिकल सेटअप. (डी) छोड़ दिया कोरोनरी धमनी के साथ एक murine (एलसीए, तीर) रोड़ा के बाद दिल की छवि. एलसीए के दृश्य पहचान और चूहों में इस्कीमिक शर्त ligation के लिए आवश्यक है. एक 8.0 नायलॉन सीवन एलसीए 1-2 मिमी के आसपास छोड़ दिया कर्ण - शष्कुल्ली के नीचे रखा है. सीवन एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब (*) के माध्यम से लड़ी पिरोया है, प्रत्येक सीवन के अंत एक छोटे से वजन (1g) से जुड़ा हुआ है और सिवनी की छड़ पर दोनों पक्षों पर रखा गया है. (ई) एलसीए रोड़ा और इवान महाधमनी में नीले रंग की डाई के इंजेक्शन प्रतिगामी के बाद एएआर का निर्धारण. एएआर अस्थिर बनी हुई है जबकि मायोकार्डियम के बाकी नीला है. टीटीसी, infarcted क्षेत्र सफेद दाग के साथ एएआर ऊतक के ऊष्मायन के बाद, जबकि व्यवहार्य ऊतक दाग लाल.

वर्तमान अध्ययन एक अक्षुण्ण murine मॉडल फांसी वजन एक प्रणाली का उपयोग में आईपी प्रदर्शन और इस तरह एक गाँठ द्वारा कोरोनरी धमनी रोड़ा से बचने का एक उपन्यास तकनीक का वर्णन करता है. वास्तव में, इस अध्ययन आईपी द्वारा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोधगलितांश आकार और हृदय संरक्षण को दर्शाता है, इस प्रकार गाँठ आधारित कोरोनरी रोड़ा मॉडलों के साथ जुड़े परिवर्तनशीलता कम से कम. जो चूहों में आईपी द्वारा cardioprotection का अध्ययन पर विचार जांचकर्ता इस मॉडल से लाभ हो सकता है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

वर्तमान अध्ययन राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान R01 HL0921 अनुदान, R01-DK083385 और एच Eltzschig R01-HL098294, टी. Eckle 1K08HL102267-01, और संज्ञाहरण शिक्षा और टी. करने के लिए अनुसंधान अनुदान के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित हैं Eckle और एच Eltzschig, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन टी. Eckle और एच Eltzschig और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) एम. Koeppen अनुसंधान के लिए फैलोशिप के लिए अनुदान. हम कला का काम शेली Eltzschig के लिए धन्यवाद.

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