Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

1. Preparar soluções estoque

1. Purificar a macromolécula de interesse. (Neste caso, aminoglicosídeo N-6'-acetiltransferase-Ii (AAC6'-II), é isolada como relatado em outros lugares. ¹³⁾
2. Prepare 4 litros de solução de diálise. (Neste caso foi utilizado 25 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, 238,3 MW g / mol), contendo 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 292,2 MW), no pH 7,5).
3. Diálise a proteína A AAC amostra (6 ')-II (5 mL a 400 mM) utilizados devem ser dialisada em tampão de diálise (3 x 1.3 L). A solução de diálise final é mantida para lavar a máquina e para diluir amostras.
4. Filtrar a solução de diálise final através de um filtro de celulose 0,45 mM, e armazenados a 4 ° C. Será referido como "tampão de corrida"
5. Solução de proteína de filtro através de um filtro de seringa 0,2 m que tenha sido lavado cuidadosamente com tampão de corrida. Medir a concentração final da proteína através de um ensaio padrão (Bradford, Lowry, etc) ou absorbância UV. Loja da proteína para maximizar a estabilidade a longo prazo. (No caso da AAC (6 ')-Ii, isto significa que o armazenamento a 4 ° C. AAC (6')-Ii não mantém atividade após congelamento e descongelamento).
6. Prepare 200μL de 25 mM solução estoque de acetil coenzima A (AcCoA, o ligante, MW 809,57) dissolvendo 4,0 mg na execução de buffer. Congelar a -78 ° C até que esteja pronto para uso.
7. Todas as proteínas e as amostras de ligante devem ser originários da mesma ação de soluções, para minimizar amostra aleatória com o modelo flutuações na concentração. Um fator de correção único para a concentração de proteína em toda a variável c dataset é ajustado na análise. ¹⁰

2. Preparação de amostras ITC

1. Diluir a solução de enzima a um c-valor de 64 com um volume final de 2 mL. (No caso da AAC (6 ')-Ii, isto corresponde a 192 mM).
2. Descongelar rapidamente o ligante solução-mãe (AcCoA) em água gelada.
3. Prepare 0,5 mL de uma solução AcCoA 10 vezes mais concentrada, em seguida, o número de sítios de ligação na proteína, neste caso 4 mM, diluindo-se 80 mL da solução estoque em 420 mL AcCoA de tampão de corrida. Transferir para um tubo de enchimento da pipeta. Retornar rapidamente a solução estoque AcCoA a -78 ° C.
4. Degas proteína e soluções sob vácuo por 5 min a uma temperatura de 1 ° C abaixo da temperatura desejada em execução (19 ° C).

3. Configurando a seringa ¹⁴

1. Inserir a seringa de injeção através de titular seringa até a braçadeira seringa pré-montada é na mesma altura que o titular.
2. Alimentar o clamp seringa, o segundo sobre a seringa de injeção até que esteja firmemente pressionado contra a parte inferior do titular seringa. Aperte levemente o grampo com o previsto "Drive Bola 0,050 Hex Point.
3. Coloque titular seringa no suporte da pipeta.
4. Deslize suavemente o injector pipeta dentro da seringa de injeção. Verifique se a ponta do êmbolo é alimentado diretamente para o buraco da seringa. Depois de completamente inserido, o anel de travamento de rosca do titular da seringa no injector da pipeta.

4. Carregando a célula de amostra ¹⁴

1. Lavar célula de amostra com um mínimo de 50 mL de tampão de corrida, e remover qualquer líquido restante usando uma longa agulha 2,5 ml seringa de vidro.
2. Lentamente desenhar um mínimo de 1,8 ml de solução de proteína na amostra limpa e seca seringa ml de longa agulha 2.5. Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas.
3. Cuidadosamente inserir a agulha em célula de amostra e gentilmente tocar o fundo da célula. Levantar a ponta ligeiramente (~ 1 mm) e gentilmente injetar AAC (6 ')-solução Ii dentro da célula até o excesso de líquido é visível acima da parte superior da célula de amostra.
4. Lentamente levantar a agulha cerca de 1 cm, garantindo permanece líquido no overflow. Rapidamente retirar e injetar uma pequena quantidade de solução (~ 0,25 ml) para remover quaisquer bolhas de presos na cela da amostra.
5. Remover todos estouro solução. Isto é conseguido, deslizando suavemente a agulha ao lado de transbordamento para dentro da célula da amostra. A ponta da seringa vai bater uma borda, esta é a altura desejo para a solução em execução. Retire todo o líquido que fica acima desta linha.

5. Carregando seringa de injeção e iniciar executar ¹⁴

1. Conecte a seringa de plástico do tubo de carga no porto de preenchimento.
2. Ponta inferior êmbolo para a parte superior da porta de preenchimento.
3. Coloque a solução AcCoA no tubo de enchimento da pipeta na parte inferior do titular da pipeta. A seringa não deve tocar o fundo do tubo de enchimento.
4. Tirar lentamente a solução para a seringa até que uma pequena quantidade entra no tubo da seringa carregamento.
5. Feche a porta encher, diminuindo a ponta do êmbolo e clique no botão Fechar porta Fill. Purga e recarga, clicando no botão Limpar-> Refill, 3 vezes para remover quaisquer bolhas de ar que pode ter ficado preso durante o carregamento.
6. Remova o tubo de enchimento do detentor pipeta e limpe a ponta da seringa.
7. Tome pipeta montagem e seringa suavemente menor para dentro da célula da amostra. Prossiga lentamente como a seringa pode facilmente dobrar, por isso muito cuidado é necessário. Garantir a seringa está completamente inserido, pressionando para baixo na base de anel externo.
8. Definir a temperatura desejada em execução (neste caso 20 ° C), e selecione uma potência de referência que é ligeiramente maior do que a vazão máxima de injeção de calor esperado (neste caso 20μcal/sec).
9. O programa de injeção de volumes desejados e atrasos. (Neste caso, 28 injeções foram empregados. A primeira injeção teve um volume de 2 mL com um atraso s 60. Todas as injeções subseqüentes tiveram volumes de 10 mL com 330 atrasos s).

6. Executa subseqüentes

1. Em todas as execuções subseqüentes repita os passos 2-5, enquanto diminui AAC (6 ')-II e concentrações AcCoA por um fator de 2,4,8,16 e 32.

7. Análise de Dados

1. Use um procedimento de ajuste, que globalmente se encaixa todas as isotermas de um único conjunto de parâmetros de ligação, como descrito anteriormente ^10.

8. Resultados representante

Dados representativos são mostrados na Figura 1. As formas das isotermas deve variar com a concentração. Transições mais nítidas são esperados para maior c-valores (ou seja, com elevado teor proteico e as concentrações de ligante) (Figura 2).

No caso da AAC (6 ')-II, o modelo de dois-site seqüencial dá um melhor ajuste do que um descrevendo dois conjuntos de idênticas, sites independentes, com estequiometrias ajustável.

Figura 1. Isotermas produzido pela titulação de AcCoA (3,86 mM) na AAC (6 ')-II (192 mm). A) trace ITC Raw. B) Os valores integrado utilizado para determinar os parâmetros de ligação (quadrados) com um encaixe 2 sites seqüencial (-).

Isotermas figura 2. ITC para AcCoA titulada em AAC (6 ')-II em concentrações variadas. Os dados experimentais (círculos abertos) estavam aptos para um modelo de 2 sets-de-sites independentes (magenta tracejada) e um modelo 2-site seqüencial (azul sólidos). O modelo 2-site sequentional claramente dá acordo de melhor no geral. As concentrações utilizadas foram A) 6 mM, 0,25 mM, B) 12 mM, 0,25 mM, C) 24 mM, 0,5 mM, D) 48 mM, 1,0 mM, E) 96 mM, 1,9 mM, e F) 196 mM, 3,86 mM, para AAC (6 ')-II e AcCoA respectivamente.

Esta parte analítica da variável c montagem foi descrito anteriormente em detalhe ^10. Aqui relatamos os aspectos práticos da coleta variável c conjuntos de dados adequados para esta abordagem. É essencial que todas as proteínas e as amostras de ligante são desenhados a partir das soluções estoque mesmo. Portanto, é importante que a solução estoque suficiente é preparado inicialmente para completar toda a série de experimentos. Isso garante que o rácio de AAC (6 ')-II e AcCoA é constante entre todos os experimentos, e reduz a flutuações aleatórias na concentração com base numa amostra para amostra.

Neste caso, muito cuidado deve ser tomado no manuseio do ligante. AcCoA é quimicamente instável em solução por isso é essencial que a solução permanece líquido por períodos muito curtos de tempo. Uma vez que a quantidade adequada é alíquotas da solução estoque, o estoque deve ser imediatamente recongelados. Se isso não for feito, então o AcCoA pode degradar ao longo do tempo e as concentrações não será correta em corridas mais tarde. Uma vez alíquotas, amostras AcCoA deve ser utilizado imediatamente. No caso de proteínas que são instáveis, as precauções semelhantes serão necessários.

Este procedimento pode ser facilmente modificado para estudar outros sistemas complexos. ¹⁰ As concentrações utilizadas devem ser adaptados para as constantes de ligação do sistema específico. Uma vasta gama de valores c entre cerca de 1 mil e ^8,10 é exigido em todo o conjunto de dados.