Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

McGovern, R. A., Harrigan, P. R., Swenson, L. C. Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3. J. Vis. Exp. (46), e2531, doi:10.3791/2531 (2010).

Bakgrund: Före få ett läkemedel från CCR5-antagonister klass HIV-behandling, måste en patient genomgå ett HIV-tropism test för att bekräfta att hans eller hennes virus befolkningen använder CCR5 coreceptor för cellulära posten och inte ett alternativ coreceptor. Ett sätt att tropism testning är att undersöka den sekvens av V3 regionen av hiv kuvertet, som interagerar med coreceptor.

Metoder: viralt RNA extraheras ur blodplasma. V3 regionen förstärks i tre exemplar med kapslade omvänt transkriptas-PCR. De förstärkningar sedan sekvenseras och analyseras med hjälp av programvara, RE_Call. Sekvenser sedan in till en bioinformatiska algoritm som geno2pheno att sluta viral tropism från V3 regionen. Sekvenser sluta vara icke-R5 om deras geno2pheno falsk positiv sjunker under 5,75%. Om någon av de tre sekvenser från ett prov sluta vara icke-R5, är patienten sannolikt inte att svara på en CCR5-antagonist.

Förfarande:

1. Extraktion:

Minst 500 mikroliter av blodplasma behövs som prov material till detta genotypisk hiv tropismtest.

1. Utdrag HIV RNA från 500μL av plasma med hjälp av en easyMAG (bioMérieux) automatiserad extraktionsutrustning eller önskad extraktion metod för ditt laboratorium.
   Eluera extraherade virus-RNA i en 60 mikroliter delmängd. Förvara vid -20 grader eller börja omvänt transkriptas-PCR direkt efter utvinna.

2. RT-PCR:

4μL av provextrakt kommer att förstärkas i tre exemplar med kapslade RT-PCR-metoder. RT-PCR-reaktion ska sättas upp i en PCR-renrum.

1. Beräkna mängden reagens som krävs för det antal prover som skall förstärkas. Följ tabellen nedan visar reagens volymer för en reaktion.
   

   Reagens	Volym (mikroliter) (1X reaktion)
   DEPC behandlat vatten	10,56
   2x reaktion buffert	20
   50% sackaros och 0,04% Bromfenolblått mix	4
   Forward primer som riktar sig till HIV-V3 regionen	0,32
   Omvänd primer	0,32
   Enzym - Upphöjd III One-Step RT-PCR-system med Platinum Taq DNA-polymeras	0,8
   Totalt	36

   Tabell 1. Reagens volymer som krävs för en reaktion i ett steg RT PCR.
   Varje steg RT-PCR-reaktion kräver följande recept:
   • 10,56 mikroliter DEPC behandlat vatten
   • 20 mikroliter av 2x reaktion buffert
   • 4μL av 50% sackaros och 0,04% Bromfenolblått mix
   • 0,32 mikroliter av framåt primer med inriktning på HIV-V3 regionen
   • 0,32 mikroliter av den omvända primer
   • 0,8 mikroliter av enzym
   För totalt 36μL per reaktion.
2. Rada upp rören provextrakt i rad bredvid en tom, märkt 96-bra PCR-plattan.
3. Med hjälp av en repeater pipett, tillsätt 36 mikroliter av provet mix till varje brunn på PCR-platta, så att det finns tre brunnar förberedd för varje provextrakt.
   * Obs: Denna procedur måste utföras i tre exemplar, åtminstone, för att säkerställa tillräcklig provtagning av virus befolkningen.
4. Använda en 8-kanals multikanalpipett, lägga 4μL av provlösningen till var och en av dess tre brunnar. Ändra tips mellan varje tillsats.
5. Täck brunnarna med PCR-band mössor.
6. När överföringen är comlete, placera PCR-plattan i en termocykler. Ställ termocykler att köra med följande program: 30 minuter vid 52 ° C 2 minuter vid 94 ° C 40 cykler (15 sekunder vid 94 ° C, 30seconds vid 55 ° C och 1,5 minuter vid 68 ° C) 5 minuter vid 68 ° C
7. Avlägsna PCR-plattan från termocykler. Tavla kan förvaras i rumstemperatur.

Gå vidare till andra omgången PCR-steget

3. Andrahandseffekter PCR:

1. Beräkna mängden reagens som krävs för det antal prover som skall förstärkas. Följ tabellen nedan visar reagens volymer för en reaktion.
   

   Reagens	Volym (mikroliter) (1X reaktion)
   DEPC behandlat vatten	13,45
   60% sackaros, 0,08% kresol röd mix	2
   Roche HiFi-system buffert 2	2
   MgCl 2	0,8
   dNTP	0,16
   Framåt PCR primer	0,15
   Omvänd PCR primer	0,15
   Expandera HiFi enzym	0,29
   Totalt	19

   Tabell 2. Reagens volymer som krävs för en reaktion av 2: ^a rundan PCR.
   Varje andra omgången PCR-reaktion kräver följande recept:
   • 13,45 mikroliter DEPC behandlat vatten
   • 2 mikroliter 60% sackaros, 0,08% kresol röd mix
   • 2 mikroliter av Roche HiFi-system buffert 2
   • 0,8 mikroliter av 25 mm MgCl ₂
   • 0,16 mikroliter av 25 mm dNTP
   • 0,15 mikroliter både framåt och bakåt PCR
   • 0,29 mikroliter Expandera HiFi-enzym
   För totalt 19 mikroliter per reaktion.
2. I en post amplifiering rum, med hjälp av en 8-kanals flerkanals pipett 1 ìl av RT-PCR-mall i den andra omgången PCR buffert. Ändra tips mellan varje tillsats.
3. Täck brunnarna med PCR-band mössor och överföra den andra omgången PCR-plattan till en termocykler.
4. Ställ termocykler att köra med följande program: 2 minuter vid 94 ° C 35 cykler (15 sekunder vid 94 ° C i 30 sekunder vid 55 ° C, 1 minut vid 72 ° C) 7 minuter vid 72 ° C
5. Avlägsna plattan från termocykler efter att temperaturen har återgått till 25 ° C.

4. Gelelektrofores:

För att bekräfta att V3 regionen framgångsrikt har kompletterats, är en gelelektrofores steg utförs.

1. Förbered en agarosgel med 0,8 g agaros pulver i 50 ml 1X TAE buffert. Rör om och smälter i mikron i ~ 1 minut eller tills agaros är fullständigt upplöst.
2. Tillsätt 6 ìl SYBR säkra gel fläcken och snurra för att blanda.
3. Häll lösningen i en gel bricka, och lägga tillräckligt gel kammar för att rymma det antal PCR-brunnar.
4. När gelen är torr, ta bort kammar och placera gelen i gelen apparaten, se till att det är helt nedsänkt i 1X TAE buffert.
5. Med hjälp av en 10 mikroliter multikanalpipett, lägg 8μL av varje PCR-prov till sin egen väl i gelen. Täck PCR-plattan efter kompletteringar har lagts till gelen.
6. Tillsätt 6 mikroliter av DNA stege till minst en brunn per rad.
7. Kör gelen apparaten på ~ 100V för ~ 10 minuter och se till att banden inte rinner av gelen.
8. Placera gelen på en UV trans-belysning och ta en bild av gelen.
   Wells med PCR amplifieras-DNA kommer att visas ljus, vilket indikerar en lyckad förstärkning.
9. Anteckna alla prover där tre kompletteringar blev succé. Om nödvändigt, upprepa RT-PCR för dessa prover med färre än 3 förstärkningar.

Gå vidare till sekvensering

5. Sekvensering:

Efter att ha förstärkt virus cDNA, kan proverna beredas för sekvensering. Kartläggningen reaktionen bör ske i en post-amplifiering rum.

1. Ta BigDye från frysen och sekvensering primers ur kylskåpet. Låt BigDye tina i rumstemperatur, inte längre än 1 timme.
2. Beräkna mängden reagens som krävs för det antal prover som ska köras. Följ tabellen nedan visar reagens volymer för en reaktion.
   

   Reagens	Volym (mikroliter) (1X reaktion)
   BigDye	0,3
   BigDye Buffer	2,1
   Primer	2,6
   Totalt	5,0

   Tabell 3. Reagens volymer som krävs för en reaktion sekvensering.
   * Notera: att förbereda en separat blandning för varje grundfärg.
   ** Obs: BigDye buffert som används i sekvensering reaktion kan beredas på följande sätt: Blanda 17,5 mL Trizma hydroklorid buffertlösning (1 M) (pH9.0) och 0,125 mL av magnesiumklorid (1 M). Ta den slutliga volymen till 100 ml med reagenskvalitet vatten. Detta bör förvaras vid 2-8 ° C.
3. Med hjälp av beräkningar från 3,3, förbereda sekvensering reaktionsmixarna för varje grundfärg och virvel inte mer än 5 sekunder. Alikvotera till 0,2 band rör.
4. Alikvotera 5 mikroliter av sekvensering reaktionsblandning i lämpliga plattan brunnarna med en flerkanalspipett. Täck skylt (ar) som innehåller blanda sekvensering reaktion med en Kimwipe och ställ åt sidan.
5. Förbered en 1:15 spädning av förstärkt PCR-produkten genom att tillsätta 180 mikroliter av Baxter sterilt vatten till de återstående PCR-produkten.
6. Pipettera 1 mikroliter av det utspädda provet till botten av lämplig plattan brunnar, byt pipettspetsar.
7. När du är klar överför prov, tätning plattan med band lock och skaka i 1 sekund
8. Placera plattan i en centrifug. Ställ in hastigheten till 145 g, när centrifugeringshastigheten når 145 g, sluta snurra.
9. Placera plattan i en termocykler (s) satt till följande program: 25 cykler (10 sek @ 96 ° C, 5 sek vid 50 ° C, 55 sek vid 60 ° C...) Volymen bör vara minst 6μL . Cykeln bör ta ungefär 1,2 timmar.

Fortsätt till nederbörd

6. Nederbörd:

Att "städa upp" den virala cDNA efter sekvensering reaktion, utföra etanol nederbörd med 95% etanol.

1. Hämta plattan från termocykler och ta med till en post-förstärkarefiering rum.
2. Ta bort remsan mössor och placera dem i ordning på en ren pappershandduk eller Kimwipe.
3. Pipettera 4μL av Working EDTA-natriumacetatlösningen på sidan av varje prov väl. Knacka försiktigt plattan så att EDTA-natriumlösning sjunker till botten av brunnen. Samma tips kan användas så länge de inte kontaktar provet på botten av brunnen.
   * Obs: arbetar EDTA-natriumacetatlösning kan beredas enligt följande:
   1. Förbered 3M Natriumacetat genom att lösa upp 246,1 g natriumacetat i 1 l reagenskvalitet vatten. Filtrera lösningen genom ett 0,45 mikrofilter och förbereda 50 ml alikvoter.
   2. Förbered Stock EDTA-natriumacetatlösning (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) genom att blanda lika volymer av natriumacetat (3 M) och EDTA-lösning (500 mM) pH 8,0.
   3. Förbered arbetar EDTA-natriumacetatlösning genom att blanda en del lager EDTA-natriumacetatlösning med tre delar reagenskvalitet vatten (10 ml + 30 ml).
4. Pipettera 40μL av kylda 95% etanol in till motsatt sida av provet brunnar och ersätta band mössor.
5. Täta mössor och virveln plattan i 10 sekunder. Tryck plattan att få bort eventuella bubblor.
6. Placera plattan i frysen vid -20 ° C i minst 30 minuter och högst 2 timmar.
7. 1. När nederbörden har inträffat, ta bort plattan från frysen och lägg i en centrifug i 20 minuter vid 3700 rpm.
   2. Ta bort lämplig mängd Hi-Di formamid (Applied Biosystems) från frysen för att kunna tina innan denaturering.
   * OBS: denaturering av en full 96-brunnar kräver 960μL av HiDi formamid och därför är det fördelaktigt att förbereda ~ 1.1mL alikvoter förväg.
8. Efter att snurra på plattan bort och kassera remsan mössor. Vänd plåten över avfallsbehållaren (t.ex. soptunna) och dekantera supernatanten. Bort eventuella återstående supernatanten genom blotting den inverterade plåtar på hushållspapper.
9. Vik 2 ark pappersduk och placeras på ytan av plattan. Placera plattan nedåt i centrifugen och snurra på 145g, stoppa snurra när den når 145g.
10. Avlägsna plattan från centrifugen och kontrollera att vara säker brunnar är tomma. Pipettera 155μL kyld 95% etanol i brunnarna.
11. Kassera supernatanten i avfallsbehållaren och skamfläck på hushållspapper och upprepa centrifugering i 4,10.
12. När du tar bort plattan från centrifugen, kassera använda hushållspapper och låt plåten stå uppåt i 2-5 minuter så att eventuella kvarvarande etanol att avdunsta.

Fortsätt till denaturering

7. Denaturering

1. Hämta tinade HiDi formamid och häll upp i en behållare stor nog för en multikanalpipett,
   * OBS: Om du använder pre-alikvoteras åtgärder som noteras i 6.7b, är en tub krävs för varje 96-brunnar som ska köras.
2. Med hjälp av en flerkanalspipett, distribuera 10μL av HiDi formamid i alla brunnarna på plattan, även de som är tomma.
3. Täck plattan med en septa matta för att bilda en säl.
4. Placera plattan i en termocykler vid 90 ° C i 2 minuter.
5. Efter denaturering, placera plattan i en hållare sedan ladda in i sequencern. Ladda upp en förberedd sekvensering layout. Plattorna kan förvaras vid -20 ° C i upp till en vecka innan du utför sekvensering sikt.

8. Analysera den resulterande data med hjälp av programvara Base Ringa.

1. Använda Recall utföra automatisk bas ringer utan mänsklig inblandning, är enda primer täckning acceptabelt. Recall är en anpassad bas kalla programvara som kan hittas på följande webbadress: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * Obs: Ett konto krävs för att logga in. För att ställa in ett konto, klicka på "Registrera"-knappen på inloggningssidan. När ett konto har skapats kan du öppna upp sidan.
2. När du är inloggad kan du välja exempelfiler för uppladdning. Använda bläddra alternativet kan du hitta din råa sekvensering data för uppladdning med en maximal uppladdning av 20Mb.
   * Obs:... Web Recall accepterar endast datafiler som ABI-och SCF-filer i en zip, tjära eller tar.gz fil
3. När filer för uppladdning har valts, välj din referens sekvens. I så fall bör du referensen sekvensen är inställd på "V3". Du är nu redo att klicka på "bearbeta data."
4. Bearbetade data kommer att visas på högra sidan under rubriken "Past Samples". Varje körning eller prov som behandlas kommer att placeras i en mapp med dagens datum. Dessa kan åter-märkt genom att klicka på "Byt namn"-knappen.
5. Genom att klicka på mappen visas en lista över prover. De som är röda har misslyckats, de som är gröna har gått. Genom att klicka på ett specifikt prov och "Visa" knappen, kan du granska sekvensen. Följ instruktionerna till höger på sidan för att navigera throuGH sekvensen.
   * OBS: För denna metod är det acceptabelt att exportera sekvenser som passerar minns (visas i grönt) automatiskt, utan manuell inblandning.
6. Om du är nöjd med resultatet kan du välja att ladda ner passerar sekvenser genom att klicka på "Download". Filer kommer att laddas ner i zippat mapp.
   * Obs: under "Inställningar" kan du välja hämta och e-post alternativ, inklusive filtyp.
7. Prover inte producera ren tre exemplar sekvenser bör reamplified i tre exemplar från extrakt. Om RePCR underlåter att lämna en ren sekvens, är minst 2 sekvenser godtagbart för användning i tropism inferens.

9. Dra slutsatsen viral tropism från Sekvenser Skapad av Populationsbaserade Sekvensering med Geno2pheno Co-receptorn algoritm.

1. Sekvenser kan köras via geno2pheno coreceptor tjänsten på följande webbadress: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. Prover för att ladda upp kan märkas som ansett det lämpligt. Från rullgardinsmenyn om betydelsen inställning, välj "optimerade cutoffs bygger på analys av kliniska data från MOTIVATE (2% och 5,75% FPR)"
3. Välj att ladda upp eller klistra in en sekvens för analys, Fasta filer är acceptabla.
4. Den geno2pheno FPR kan tolkas som följer: G2P FPR> 5,75 är representativt för en R5-virus med hjälp av befolkningen, benägna att svara på CCR5-antagonister G2P FPR <5,75 är representativt för en icke-R5 virus befolkningen, sannolikt inte att svara på CCR5-antagonister. G2P <2 är mycket osannolikt att få något svar på CCR5-antagonister. Om någon av de tre sekvenser från ett prov sluta vara icke-R5, är att patienten inte kommer att svara på en CCR5-antagonist.

10. Representativa resultat

När protokollet utförs på rätt sätt bör man räkna med att framgångsrikt sekvens 2 eller 3 replikat för varje prov. Negativa löpa parallellt prover bör inte ha några tecken på RNA. De flesta av sekvenserna bör "pass" basecalling av Recall.

Utifrån fördelningen av R5 och icke-R5 i samhället virala befolkning skulle majoriteten av slumpmässigt utvalda patientprover förväntas få R5-användande virus. Därför om projektets utformning skulle föreslå något annat, bör man förvänta sig att ha mer R5 än icke-R5 prover.

Tabell 1. A) reagens volymer som krävs för en reaktion på ett steg RT-PCR och B) termocykler programmet behövs för att genomföra RT-PCR-reaktionen.

A)

* Obs!
SQV3F1 primer sekvens: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3 "
CO602 primer sekvens: 5 'GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC Luftfartsverket GAA CC 3 "

B)

Tabell 2. A) reagens volymer som krävs för en reaktion av andra omgången PCR och B) termocykler programmet behövs för att utföra den andra omgången PCR-reaktionen.

A)

* Obs!
SQV3F2 primer sekvens: 5 'TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG AT 3 "
CD4R primer sekvens: 5 'TAT AAT TCA CTT CTC Luftfartsverket TTG TCC 3 "

B)

Tabell 3. A) reagens volymer som krävs för en reaktion sekvensering och B) termocykler programmet som behövs för att utföra sekvensering reaktion.

A)

* OBS: Blanda inte grundfärg, en separat blandning bör vara redo för varje primer
V3O2F primer sekvens: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA Luftfartsverket TGT ACA C 3 "
SQV3R1 primer sekvens: 5 'GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3 "

B)

Den metod som presenteras här är en standard sekvensering som tillämpas på tropism testning. Den kliniska tillämpningen av HIV kuvert V3 loop sekvensering att förutsäga viral tropism har fram till slutet varit begränsad. Denna metod har visat sig i retrospektiva analyser av maraviroc (Viiv Healthcare) kliniska prövningar, att vara på minst lika kunna förutsäga viral tropism i jämförelse med andra validerade test som används kliniskt.

Det finns många fördelar att utföra genotypisk analys av V3 loopen för tropism förutsägelse. Först och främst kan detta göras vid varje anläggning med operativa sekvensering utrustning, kraftigt öka tillgängligheten och minska handläggningstid av tropism testning. I jämförelse är den fenotypiska ökad känslighet Trofile metoden (ESTA) (Monogram Biosciences), som har fungerat som den gyllene standarden för tropism test, utförs på ett center i södra Kalifornien. Ytterligare fördelar är bland annat kravet på mindre utgångsmaterial och ett minimum som krävs virusmängd i plasma av 500copies/mL. Som väl de operativa kostnaderna för att driva genotypiska analysen är relativt låga i jämförelse med dem i en fenotypisk analys. Användningen av Recall programvara särskilt eliminerar kravet på manuell sekvens granskning, som tenderar att vara arbetsintensiv del av genotyp analyser.

Den metod som presenteras här är ganska enkelt, utan någon särskild steg uppväger varandra i betydelse. Vi föreslår att du kör PCR och sekvensering i tre exemplar för att öka oddsen för att fånga minoritet arter inom virala befolkningen i ett prov. Replikerar större än tre kan utföras, tre exemplar men vi har funnit sig vara både effektiv och tillförlitlig. Vi föreslår också att du använder ett steg omvänt transkriptas PCR-Kit (Qiagen) som utför både RT-PCR och i första omgången PCR i samma reaktion med bibehållen hög sensitivitet och specificitet.

P. Richard Harrigan har intressekonflikter med Viiv Healthcare, Virco, Merck, Abbott, och Quest. Denna video-artikeln är sponsrad av Viiv Healthcare.

Utvecklingen av denna analys stöddes av Viiv Healthcare och den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) och genom ett GlaxoSmithKline / CIHR professuren i klinisk virologi för Dr Harrigan.

Stöd från Pfizer och Viiv Healthcare.

1. Feng, Y., Broder, C.C., Kennedy, P.E., et al. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 272, 872-77 (1996).
2. Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G.P., et al. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature 381: 667-673 (1996).
3. Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S., et al. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
4. Gulick, R.M., Lalezari, J., Goodrich, J. et al. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
5. Cooper, D.A., Heera, J., Goodrich, J. et al. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201:803-813 (2010).
6. Low, A.J., McGovern, R.A., Harrigan, P.R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics 3: 181-191 (2000).
7. Sing, T., Low, A.J., Beerenwinkel, N., et al. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12: 1097-1106 (2007).
8. Harrigan, P.R., McGovern, R., Dong, W., et al. Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Presented at: 5^th International AIDS Society Conference. Cape Town, South Africa, 19-22 July 2009, Abstract WELBA101 (2009).
9. McGovern, R.A., Dong, W., Mo, T., et al. Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Presented at: 12th European AIDS Conference. Cologne, Germany, 11-14 November 2009, Abstract PE3.4/8 (2009).
10. Swenson, L.C., McGovern, R.A., Dong, W. et al. Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Presented at: 47^th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Philadelphia, PA, USA, 29 October-1 November 2009, Abstract 297 (2009).
11. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W., et al. Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Presented at: 49^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, 2009 12-15 September (2009).
12. Swenson, L.C., Moores, A., Low, A.J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M.A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P.R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 54(5):506-510 (2010).
13. Swenson, L.C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R.A., Harrigan, P.R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy 4(3): 293-303 (2010).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.